1、出血性疾病的实验室诊断,瑞金医院,止血过程,BV Injury,Platelet Activation,Plt-Fusion,Blood Vessel Constriction,Coagulation Activation,Stable Hemostatic Plug,Thromibn, Fibrin,Reduced Blood flow,Tissue Factor,Primary hemostatic plug,Neural,出血性疾病的诊断流程,凝血因子缺陷症检测,凝血途径,Fg，TT,血友病筛选及诊断试验,PT APTT TT Fg,筛选试验,混合试验,凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检
2、测FVIII抑制物类肝素狼疮抗凝物质,纠正,不纠正,确诊试验,混合试验(mixing test),PT延长3， APTT延长5 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 即刻检测，37C孵育2h后检测 结果判断： X+2SD 不纠正,Mixing test 结果判断,因子缺陷APTT参考范围26-34sAPTT 60s APTT1:1mix 32sAPTT被纠正 因子缺陷,抑制物APTT参考范围26-34sAPTT 60s APTT1:1 mix 40sAPTT不被纠正 抑制物存在,Mixing test 结果解释,aPTT results Example 1 2 3 A - normal pla
3、sma 30” 30” 30” B - test plasma 90” 90” 90” C - test+normal (incubated) 35” 70” 70” D - test+normal (non-incubated) 35” 48” 70”Example 1 因子缺乏 Example 2 FVIII抑制物 Example 3 即刻反应抑制物,Mixing test 应用,初步判断： 凝血因子缺陷 FVIII抑制物存在 狼疮抗凝物质存在,活性测定凝固点法 一步法 （One-Stage）-临床测定参比方法 两步法（Two-Stage）发色底物法 （Chromogenic Factor
4、 VIII Assay） 抗原测定ELISA,凝血因子活性和抗原检测,一步法检测FVIII:C (One-Stage),原理： 基于 APTT凝固法 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 制备标准曲线,FVIII:C检测,One-stage Factor VIII Assay,试剂因素：磷脂 激活剂 乏FVIII血浆 血友病A血浆 免疫吸附制备 VWF含量正常,因子缺陷敏感的APTT试剂,发色底物测定原理,发色底物测定原理,直接一步测定 FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm)直接两步测定 (
5、Chromogenic FVIII) FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa间接测定 (AT activity assay) （AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa,发色底物法分类,发色底物法测定F VIII:C,商品化试剂盒 两步法的原理 SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测定参比方法凝固法和发色底物法,抑制物检测方法,Bethesda法 Nijmegen modification,狼疮抗凝物质检测,相关概念,临床疑似APS APTT延长 混合试
6、验证实有抑制物存在 排除肝素导致的APTT延长TTRT,狼疮抗凝物质(LA)检测,检测方法,ELISA法检测：抗心磷脂抗体抗磷脂抗体2GPI抗凝血酶原抗体 功能测定-凝固为基础的检测用狼疮抗凝物质检测2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物基于PT、APTT、dRVVT 的测定,血管性血友病（VWD）,VWD,血管性血友病因子（VWF）数量或者结构异常引起3个型（1型、2型、3型）2型分为2A、2B、2M、2N四个亚型,VWD诊断,FVIII:C VWF:Ag VWF:RCo BT PFA-100 VWF多聚体检测 胶原结合试验 FVIII结合试验,PFA-100 Platelet Funct
7、ion Analyzer,Trigger solution container,Soft keys,LCD screen,Built-In Printer,Carousel,Cassette,Test Cartridge,体内止血,PFA-100,capillary 200m,aperture 150m,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,FLOW,- 40 mbar,collagen,membrane,PFA-100 检测原理,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,en
8、dothelial cell,vWF,PFA-100 检测原理,堵塞过程,Data scatter of all study groups :,0,50,100,150,200,250,300,300,250,200,150,100,50,0,Closure Time for Col/Epi (sec),Closure Time for Col/ADP (sec),To : Meyer, Fressinaud et al.,Normals,vWD Type 1,vWD Type 2,vWD Type 3,诊断VWD,PFA-100 临床应用,To : Meyer, Fressinaud et
9、al.,Sensitivity in vWD Type 1,Comparison of Bleeding Time (BT) and Closure Time (CT) in Type 1 vWD,BT (min),20,5,10,15,0,Epinephrine,ADP,CT (s),250,200,150,100,50,PFA-100 Clinical Application,Sensitivity for vWD - Overview,BT Col/Epi Col/ADP Type 1 53% 94% 100% (n=36) Type 2 (no 2N) 85% 100% 100% (n
10、=13) Type 3 100% 100% 100% (n=4) Acquired 80% 100% 100% (n=5),PFA-100 Clinical Application,To : Meyer, Fressinaud et al.,Bleeding Time vs PHC (Col/Epi and Col/ADP closure times),多聚体电泳,2A,N,2M,2M,FVIII结合试验, FVIII结合力降低,血小板功能异常性疾病,血小板功能检测,血小板计数 血涂片检查 血块收缩实验（血小板与Fb的相互作用）,血小板功能检测,出血时间（BT)：血小板和血管功能,Sensit
11、ivity to Hereditary Platelet Defects,0,50,100,150,200,250,300,300,250,200,150,100,50,0,Closure Time for Col/ADP (sec),Closure Time for Col/Epi (sec),Normals,Glanzmann,Bernard S.,Giant Pl.S.,Storage P.D.,Data scatter of all study groups :,To : Mller, Kirchmaier et al. ; Frankfurt aM.,PFA-100 检测,血小板聚集
12、试验-原理,常用诱导剂诱导的血小板聚集 ADP 胶原 肾上腺素 瑞斯托霉素 花生四烯酸,正常人不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应,不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应 -服用阿司匹林后,流式细胞仪的应用,BernardSoulier syndromeGPIb-, GPIX-, and GPV-特异单克隆抗体 Glanzmann thrombastheniaIIb- 和 3-特异性单克隆抗体 Storage pool disease5-羟色胺特异的单克隆抗体,血小板无力症流式检测结果,注：A. 先证者2的流式检测图（型 GT）；B. 先证者6的流式检测图（型 GT）。 横坐标：荧光强度；纵坐标：细胞数比率（）。 红色曲线：正常人对照；蓝色曲线：患者。CD42b 用于设门,电镜检查,应用不同的电镜技术 可以分析血小板胞浆内的内容物和颗粒 有助于血小板贮存池病和血小板释放障碍的诊断,出血性疾病的检测,凝血因子缺陷症检测 抗凝物质增多检测 凝血因子抑制物检测 VWD检测 血小板功能缺陷检测,谢谢！,
