1、HLA 新等位基因 A*3018 的序列分析和确认(1)作者：李桢，邹红岩，邵超鹏，孙革，金士正，程良红【摘要】为了识别和确认中国汉族人群中的 HLA 新等位基因，使用 PCRSSP 、FLOWSSO 以及 PCRSBT 等 HLA分型技术，发现样本 A 位点的杂合结果 A*240201，300101在外显子 2 有 3 个位置与数据库不相符。用组特异性引物分别扩增 A*24 及 A*30 基因，对外显子 2、3、4 进行双向测序，发现 1 个与 A*300101 序列相近的新等位基因。分析该等位基因与 A*300101 序列的差异。用 EB 病毒感染外周血 B 淋巴细胞，建立该等位基因的无限
2、增殖化 B 淋巴细胞系。结果表明：该基因与 A*300101 相比在外显子 2 有 3 个碱基的改变，碱基 121AC、123TC 导致密码子17AGTCGC,17S （丝氨酸）R（精氨酸） ；碱基 126AG导致密码子 18GGAGGG，18G（甘氨酸）G（甘氨酸） ，该氨基酸是同义突变。成功建立了该等位基因的无限增殖化B 淋巴细胞系，该基因序列已提交 GenBank，编号为DQ872509。结论：该等位基因为新的 HLAA 等位基因，已于 XX 年 8 月被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名为 HLAA*3018 （上报编号 HWS10004039） 。【关键词】人类白细胞抗原I
3、dentificationandSequenceAnalysisofANovelHLAA*3018AlleleAbstractToidentifyHLAnovelalleleinChineseHanindividuals,anunknownHLAAallelewasdetectedbyPCRSSPandFLOWSSOinChineseHanindividuals.Heterozygoussequencebasedtypingshowedthattherewere3differencescomparedwithdatabaseinexon2.Itsanomalouspatternssuggest
4、edthepossiblepresenceofeitheranovelA*30 or anovelA*24.Toseparatethetwoallelesandtodeterminewhetherthealleleisnovel,theHLAA*30andHLAA*24alleleswereamplifiedseparatelybyusingacommercialkitforthesingleallelespecificsequencingstrategy,andbothallelesforexons24weresequencedaccordingtothemanufacturerprotoc
5、ol.ToprepareBlymphoblastoidcelllineofthenovelHLAallelebyusingEpsteinBarrvirusinfectedBlymphoblastoidcellsintheperipheralblood.TheresultsindicatedthatthesequencingresultsshowedHLAAallelesofthesampletobeHLAA*240201andanewA*30allele.ThesequencesofthenewA*30wereidenticaltothoseofHLAA*300101exceptforthre
6、enucleotidechangesinexon2:atnt121,nt123andnt126,resultinginanaminoacidresiduesubstitutionfromStoRatcodon17andasynonymoussubstitutionfromGtoGatcodon18.ImmortalizedBlymphoblastoidcelllineofthenovelHLAA*3018allelewasachieved,thesequenceofHLAA*3018allelewassubmittedtoGenBankanditsaccessionnumberwasDQ872
7、509.Inconclosion,theHLAA*3018isanovelHLAAalleleandhasbeenofficiallynamedHLAA*3018bytheWHONomenclaturecommitteeinAugustXX（HWS10004039）.KeywordsHLA;HLAAallele;HLAA*3018;sequenceanalysis人类白细胞抗原（HLA）系统在遗传学、法医学和移植免疫中起着非常重要的作用。近几年来，随着分子生物学的发展及测序技术的推广，HLA 新等位基因不断被发现。截止目前，人类白细胞抗原的 A 位点已有 450 个基因，A*30组已发现 20
8、 个等位基因1 。我们在常规工作中发现一份标本，PCRSSP 分型结果 A 位点为 A*24， ，FLOWSSO分型结果为 A*24，30，即两种试剂出现了不同的分型结果。杂合测序显示 HLAA*240201 ，300101 的杂合结果在外显子 2 有 3 个碱基与数据库（IMGT/HLArelease,AprilXX）不相符。我们用组特异性引物分别扩增了 A*24 及 A*30 基因，对其分别进行外显子 2、3、4 的双向测序，发现一个与A*300101 序列相近的新等位基因，其血清学特异性有待进一步确认。该基因被世界卫生组织 HLA 命名委员会正式命名为 HLAA*3018 。此样本的 H
9、LA 分型结果为A*3018/A*240201,B*1301/B*材料和方法样本来源中华造血干细胞捐献者资料库志愿捐献者，男性，汉族，籍贯河南。家系调查采集先证者父母的血样。随机抽选本中心 500 名造血干细胞捐献者进行基因频率调查。DNA 快速提取试剂盒由美国 Gentra 公司提供。HLA 低分辨率基因分型试剂由美国 G&T 公司（试剂批号 LotRF08）以及美国 OneLambda 公司（试剂批号 HLAALot007 ）提供。高分辨率基因分型试剂中杂合测序试剂盒使用AtriaGeneticsAlleleSEQRHLABSBTPack （AtriaGenetics,SouthSanFr
10、ancisco,CA） ；单基因扩增测序使用ProtransS4HLAAsingleallelespecificsequencingset（ProtransGmbH,Ketsch,Germany） 。淋巴细胞分离液由上海恒信试剂厂提供。RPMI1640 培养液为 Sigma 公司产品。A*3018 序列特异性引物合成及 PCR 所需试剂由大连宝生物公司提供。主要仪器9700PCR 扩增仪（PE 公司产品） ，电泳仪（美国 Embi公司产品） ，流式磁珠分析仪（Luminex100 液相分析平台） ，3100 测序仪（AppliedBiosystems 公司产品） ，CO2 培养箱（德国 Her
11、aeusBBD6220 型） 。HLA 分型及序列分析使用 5%EDTA 抗凝外周全血，取 300l 用 DNA 快速提取试剂盒提取 DNA。HLA 低分辨率分型采用了 PCRSSP 以及 FLOWSSO 两种方法。高分辨率分型先使用了AtriaGeneticsAlleleSEQRHLABSBTPack 进行杂合测序，分析软件使用 AssignversionXX0714 版本，最后使用ProtransS4HLAAsingleallelespecificsequencingset分别扩增 A*24 及 A*30 基因，并对外显子 2、3、4 进行双向测序，从而确认突变基因。分析软件使用 Sequ
12、encepilot版本。HLAA*3018 等位基因的 PCRSSP 鉴定设计序列特异性引物见表 1。采用双管 PCR 特异性扩增A*3018 等位基因。该两对引物扩增结果均阳性即为 A*3018等位基因。PCR 扩增反应体系为 25l，其中 10PCR 缓冲液 l，MgCl2 终浓度 mmol/L，dNTP 终浓度 mmol/L，引物终浓度 mol/L，TaqDNA 聚合酶 U，DNA80ng。扩增条件为94预变性 1 分钟，94变性 30 秒、58退火 30 秒，72延伸 30 秒，共 35 个循环，最后 1 循环 72延伸 5 分钟后冷却至 4。取扩增后标本 10l，置于 20g/L 琼脂糖凝胶中电泳。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
