1、DXS6804 基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究(1)【摘要】 目的用分子克隆技术制备 DXS6804 基因座等位基因分型标准物，并用于中国云南普米族人群的群体遗传学研究，解决长期困扰短串联重复序列分型上存在的准确性和标准化问题。方法用 PCR 扩增出 DXS6804 基因座的各等位基因片段，PCR 产物克隆后，DNA 测序证实插入片段的大小和结构，按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后，制备出该基因座的等位基因分型标准物，进行群体研究。结果调查了中国云南地区普米族人群基因座的基因型分布频率，发现 DXS6804 基因座两个分型标准物外等位基因。结论分子克隆技术是
2、制备等位基因分型标准物的可靠方法，DXS6804 基因座是一个适合我国法医学和群体遗传学分析的遗传标记。【关键词】等位基因分型标准物；短串联重复序列；遗传多态性StudyontheconstructionofstandardDXS6804allelicladderviamolecularcloninganditsgeneticpolymorphism inChineseyunnanpumipopulationsABSTRACT:ObjectiveToresolvetheproblemoftheaccuracyandstandardizationofSTRPCRtypinginforensicp
3、ractice,constructDXS6804allelicladderbymolecularclonningandapplytheminapopulationstudyonthePumipopulationinYunnan,China.MethodsPCRwasusedtoproduceseveraldifferentallelicfragmentsofthelocus.AftercloningthePCRproducts,therecombinantplasmidsweresequenced.Thenwedenominatedthemandusedthemastemplateforrea
4、mplificationtogeneratethelocusstandardladder.ResultsThesequencingresultsconfirmedthatthesizeandtheconstructionoftheinsertswerecorrect.ThegeneticpolymorphismsofthislocusinYunnanPumipopulationofChinawerestudied.TwooffladderallelesofDXS6804locuswerefound.ConclusionThismethodisofhighvalueforforensicDNAt
5、ypingtoconstructstandardladders.DXS6804isrobustforgeneticresearchandforensicapplication.KEYWORDS:allelicladder;shorttandemrepeats;geneticpolymorphism短串联重复序列是一类在人类基因组中分布广泛并且具有高度多态性的遗传标记。具有分型检测所需检材量少、尤其适合降解 DNA 的扩增等优点，被广泛应用于法医学个体识别和同一认定以及民事案件中的亲权鉴定12 。特别是 X 染色体 STR 基因座，具有扩增片段短、等位基因多、分型方法简单、多态信息含量高的优点，
6、更受到格外关注。而且它特别适用于法医学实践中在母方缺如情况下兄弟姐妹的亲权鉴定，另外，也可以作为性别的辅助鉴定，为法医学研究提供了一种新的工具。但是，由于目前已知的 X染色体多态性遗传标记的数量较少，适用于法医学的更少，而且其研究方法还处于摸索阶段3。等位基因分型标准物是人群中常见的等位基因混合物，用来与未知样品比对确定基因型。只有具备了一套精确的、国际标准化命名的标准参照物，才有可能对 STR 分型结果作出正确的判型和命名,STR 数据才能在各实验室之间进行交流和合作4。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外首先制备出 DXS6804 基因座的等位基因分型标准物。应用自制的等位基因分型标准物，
7、首次调查了中国云南地区普米族人群基因型分布频率，评价该基因座在法医学和群体遗传学中的应用价值。1 对象与方法对象样本遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区 100名普米族群体中无亲缘关系个体的静脉血，EDTA 抗凝，-70保存。引物引物序列查自 GenBank，由奥科公司合成。试剂 2XTaqpolymerasemix 和 DH5 感受态细胞；质粒纯化试剂盒；pGEMTEasyVectorSystem ；聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试剂盒；EDTA 等其余试剂均为国产分析纯。仪器台式高速离心机；微量可调加样器；三相恒压电泳仪；干热器；旋涡混匀器；超净工作台；低温冰箱；ABI3730 自动测序仪
8、。方法制备标准分型物模板 DNA 通过 Chelex100 法5提取云南普米族群体样本 DNA，PCR 扩增。反应体系：总体积13L，2Taqpolymerasemix6L，引物1L，DNA2L，H2O2L。反应条件见表 1。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，银染显色67 。从群体样本的扩增产物中，选出了 9 个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试剂盒纯化各个片断，制备成 PCR 再扩增的模板。PCR 再扩增、产物鉴定及纯化将制备好的 9 份 DNA 进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。PCR 产物的克隆采用
9、 pGEMTEasyVectorSystem 克隆试剂盒，将纯化后的 PCR 片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化 DH5 感受态细胞，选择培养，再用以上的扩增方法筛选出含有正确插入片段的克隆。重组质粒的 DNA 测序采用 ABI3730 全自动遗传分析仪，以质粒公用的 M13 正向引物对重组质粒的插入片段进行测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会推荐的命名原则进行各等位基因命名89 。重组质粒的扩大培养及保存对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养。提取质粒后,得到该基因座的等位基因分型标准参照物的重组质粒。菌液加甘油后，-70保存。等位基因分型标准物的制备和再鉴定以含该基因座等位基因插入片段的重组质粒 DNA 为模板,进行 PCR 扩增，反应体系及条件如前。纯化该基因座各等位基因的 PCR 产物，混合制备成等位基因分型标准物,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得分型标准物的可用性。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
