1、植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用2002 年海洋湖沼通报TransactionsofOceanologyandLimnologyNo4文章编号:l0036482(2002)04OO56O7植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用张亚萍于文功戴继勋管华诗(青岛海洋大学,I 海洋药物与食晶研究所,2 生命学院.青岛.266003)摘要:利用酶解技术制备高活力的条斑紫菜原生质体 ;通过优化原生质体的制备工艺和培养条件,建立了条斑紫菜原生质体的无菌培养体系.同时首次证明了高等植物组织培养中常用的两种激素 NAA 和 6 一 BA 对紫菜细胞生长具有明显地促进作用,并应用这两种激素建立了条斑
2、紫菜原生质体的固体培养方法.为开展紫菜遗传转化中阳性克隆的定向筛选,以及探讨紫菜的基础生理生化反应机制奠定了艮好出.关键词:条斑紫菜原生质体固体培养 NAA6 一 BA中图分类号:Q949.292,1 文献标识码:A近年来,大量生态学及生源学的研究结果表明,海洋生物活性物质的初始来源大部分甚至可能全部是来自低级海洋生物如藻类及其共生菌类.海洋藻类的研究与开发利用已成为当今海洋生物技术主要的研究方向,红藻门中的紫菜是目前经济价值最高的一种养殖海藻【11.我国是紫菜养殖大国,紫菜已成为我国海藻养殖业的支柱品种和主要的出口创汇海产品.但随着养殖规模逐步扩大,目前紫菜养殖业面临着养殖品种退化和病害颁发
3、【的严峻局面,暴露出紫菜基础研究薄弱的弊端.因此,开展紫菜基因_T 程研究,利用现代分子生物学的育种方法培育紫菜新品种是十分迫切和必要的.紫菜生活史已经十分明确.其配子体即宏观叶状体时期是单倍体世代,染色体数为27条,基因组大小是 2.75.3IO.bpst.紫菜叶状体大多为单层细胞 ,藻体形态结构简单,细胞发育分化易于调控;酶解条斑紫菜产生原生质体及原生质体的再生技术已经日渐成熟.以上诸多特点说明.条斑紫菜易于进行分子水平上的研究.具备良好的遗传操作可行性.现在紫菜己成为公认的海洋植物基础和应用研究理想的模式生物.紫菜基因工程研究尚处于起步阶段,目前只开展了电击转化 Porphyramini
4、atat1 和 Porphyrahaitanensis151 原生质体进行瞬间表达的研究.为了进行紫菜的稳定遗传转化研究,必须建立成熟的原生质体再生培养方法.这对于基因转化后阳性克隆的筛选是不容忽视的重要环节.但在常规的原生质体液体培养第一作者简介:张亚萍,女.1979 年出生.硕上研究生.j 蠡讯作者:于文功.男.1962 年出生.教授.博士生导师.电话:0532.2032067,E.瑚il:yIengongpublic,qd.sd.a1.收稿口期:20014-l84 期植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用中,由于其生长环境的局限性,无法实现对细胞个体的具体观察研究,因此需要进行原生质
5、体的固定化培养研究.本文着重于条斑紫菜原生质体固体培养方法学的建立,首次利用高等植物组织培养中常用的两种激素 NAA(d 一萘乙酸 )和 6 一 BA(6 一苄基腺嘌呤)成功地进行了条斑紫菜原生质体固体培养.1 材料与方法1.1 材料与设备条斑紫菜(Porphyrayezoensis)2000 年 11 月采自青岛红岛镇,阴干后一 20保存.海螺酶制品按青岛海洋大学生命学院万顺教授的方法【1 制备.用 0.22IXm 滤膜过滤除菌,.80分装保存.NAA(d-Naphthaleneaceticacid)和 6-BA(6 一 Benzyladenine)购自山东省农科院赛崽斯公司.GeO(二氧化
6、锗 )购自 JIJ 东省青岛市华东化玻公司.卡那霉素购自 IJ 东省农科院赛恩斯公司.所用试验设备:OlympusCH30 型显微镜(日本),Olympus1X 一 70 倒置荧光显微镜(日本),JouanBR4I 型离心机( 法国),GXZ 型智能光照培养箱(宁波).1.2 方法实验流程:覆一西回 r 面一.萌1.2.1 原生质体的制备原生质体的制备基采用戴继勋等的方法【,但由于同体培养对于无菌的严格要求,在实验的各个环节均强化了无菌操作.1.挑选生长状况良好的藻体,将基部的假根和边缘的生殖细胞(果孢子囊和精子囊)去除,只保留营养细胞部分;在含有 lOmg/LKNO3 一 N 和 0.4mg
7、,/LKH2PO4 一 P 的消毒海水中复苏 24h.然后用超声波处理 3 次 OOS/次),每次处理后用无菌海水清洗数次,随后浸入 0.7%KI 和 0.1%Ampiclllin 内各 10rain,再用无菌海水清洗干净.复苏过程中清洗不彻底易引起原生动物和杂藻的污染,所以要将其刷洗 810 遍,最后放入 0.8mg/L 的二氧化锗溶液里浸泡过夜.2.收集酶解后的原生质体,无菌海水反复离心洗涤 3 次,彻底除去酶液;之后放入加有 0.8mg/LGe02 的无菌海水中浸泡 20rain,反复清洗三次后备用.3.实验中所用各种器皿均作严格无菌处理.1.2.2 原生质体的固体培养1.固体培养基的配
8、置:(附加 10g/mLKN03 一 N 和 0.4g/mLKH2P04 一 P 的无菌海水 ,添加浓度为O.6% 0.7%的琼脂糖配成基本培养基 .试验组加入 NAA(0.2IXg/mL,0.1IXg/mL,0.05Ixg/mL,0Ixg/mL)6-BA(浓度分别 2.0Ixg/mL,1.oIxegmL,0.5 咖 L,0Ixg/mL)两种海洋湖沼通报 2002 年激素.按照正式试验原理设汁 16 组不同的培养基,每组均设三个平行对照;121C高压灭菌15min,在培养基温度降至 65cc 时,加入终浓度为 100g/mL 的卡那霉素.2,同体培养:将紫菜原生质体以 100cclls/cm
9、左右的密度均匀涂布于固体培养基表面,Parafilm膜封口后,放入光照培养箱中.如果经常观察导致培养基表面湿度降低,则在培养基表面(直径9cm)添加 12mL 无菌营养海水.培养温度:19.5,光强:100molphotonmS,光照周期:12L:I2D2.结果条斑紫菜原生质体在固体培养基表面生长到第 34d 再生出细胞壁,而液体培养时通常12d 就长出新的细胞壁;在第 57d 开始第一次分裂 ,比在液体培养中晚 3 天左右;阎体培养【卜 J细胞仔活率约为 52%,远低于液体培养时 80%左右的细胞存活率.在培养的最初 20 天里,细胞生长缓慢但是发育正常.由于细胞所处生理状态不同,发育途径也
10、存在差异.最幼暾的基部营养细胞首先极性化,再沿长轴横向开始第一次分裂;位于下面的细胞液泡化增大阻,然后在顶端长出无色透明,粗壮的假根;上面的细胞继续横向分裂多次 ,形成排列为一条线的单列细胞构成的幼苗,然后纵向分裂多次形成单层细胞的叶状体(图 1).另一类营养细胞在第一次细胞分裂之前,先形成一层透明的膜,然后在膜内向各个方向多次分裂形成多细胞团,膜的大小随着细胞团的增大而增大(图 2)j 叶状体,多细胞团在开始的 4周内生长良好,每个个体都能长到含有 4o-_100 个细胞.4 周后,由于固体培养基上营养物质的消耗和有毒代谢副产物的增加,限制了叶状体或多细胞团的进一步生长;实验组与空白对照组均
11、出现叶片发白,细胞质分解的现象,留下空的细胞壁;大量的单孢子由于多细胞团或部分叶状体的分解而放散出来(图 3).单孢子具有明显的中央色素体,形状单一,不具有细胞壁,能够再生出形态正常的幼苗(图 4).6_BAConcentration(g/mL)图 7 紫菜原生质体在 NAA 和不lu浓度 6-BA 下外植体的冉生率Fig.7ThallusRegenerationRateofEyezoeisprotoplatsjnNAAand6-BAofdifferents,oneentratons%如如 04 期植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用在加人不同浓度 NAA 和 6 一 BA 的固体培养条
12、件下,细胞生长迅速,细胞首次分裂时间比对照组提前 2d 左右;培养 20d 时,与对照组相比出现更多健康生长的 /,ni-片和多细胞团;尤其在生长的中后期(3od 左右),试验组分裂速度明显加快,叶片约有 23cm长,在显微镜(40x)下可看到很多棕红色的宽大叶片,呈舒展状或卷曲状(图 5);膨大的多细胞团内含较多的单孢子细胞,单孢子放散的时间也提前 5d 左右,孢子苗生长速度加快,呈淡红色,形态细长,与宽大的体细胞苗有明显区别.实验中发现,0.1g/mLNAA 相对于其它不同浓度组促生长效果最佳,存活率为 57%;在最初培养的几天内 ,6 一 BA 浓度为0.5gmL的试验组原生质体生长较好
13、,长出假根的时间和细胞初次分裂的时间都比其它组要早:但是到第 20d 左右,在 6 一 BA 浓度为 1.0g/mL 的培养基表面生长的紫菜细胞,不论在细胞个体大小还是长假根的细胞比率上,都大大地超过其他各组中生长的细胞(图 6),与其他组相 tL,b 植体再生率较高( 图 7).由此可以推断在紫菜细胞生长的不同时期,不同浓度的植物激素对其影响亦随之发生变化,这可能是由于不同的生长发育阶段对于植物激素的需要量不同.此推论与其它报道是一致的 I.3 讨论3.1 初步建立紫菜细胞无菌培养体系已很难获得真正无菌的藻体组织,近年来紫菜组织只培养停留在少菌而不是无菌的阶段 lm】.尽管实验用具和操作人员
14、的双手经过消毒,作为污染源的种藻仍然是带菌者;同时也必须注意到在植物生长激素的研究中,如果没有无菌材料是很难完成并得到可信的结论【“ 】 .为此 ,在紫菜细胞培养的每一步都必须努力做到无菌操作.紫菜种藻酶解前在 0.8mg/LGeO 溶液中浸泡过夜以及收集原生质体时再次用 0.8mg,LGe0:溶液浸泡 20min,可以较好地去除绿藻,浒苔等杂藻的污染;酶解前反复洗刷种藻 8l0 遍,可以彻底清除原生动物;同时海螺酶经 0.22m 滤膜过滤除菌,光照培养箱用 75%乙醇多次消毒,试验工作间经紫外线反复消毒等.总之,在紫菜细胞培养的每个环节都努力做到无菌操作,我们良好的实验结果及其稳定的可重复性
15、说明了紫菜无菌培养的可操作性.3.2 植物激素在海藻细胞培养中的作用植物激素在海藻组织培养中是否有效,是藻类学界长期以来争议的问题 I 坨】.由于海藻种属及取材部位的不同,对于各种激素的反应也是不同的.一般认为,植物激素能够诱导愈伤组织形成并促进其生长;相对于褐藻而言,植物激素对红藻属植物的调节作用更为明显【“ 】 .借鉴高等植物组培中的经验,经过一系列的预试验后选定了 NAA 和 6一 BA 两种激素,并确定 NAA 的合适浓度为 0.1g/mL.NAA 是人工合成的生长素 ,可以活质化膜上的 ATP 酶,促进细胞壁环境酸化,增加可塑性,从而增强细胞渗透吸水的能力 ;同时促进RNA 和蛋白质
16、的合成,为原生质体和细胞壁的合成提供原料,保持持久性生长.6一 BA 是人工合成的绌胞分裂素,细胞分裂素的生理作用是多方面的,主要是通过对生物体在转录和翻译水平上的控制促进细胞分裂.6 一 BA 与其受体蛋白结合后 ,增强 RNA 聚合酶的活性,促进 RNA 合成;由于细胞分裂素存在于核糖体上,促进核糖体与 mRNA 结合,形成多核60 海洋湖沼通报 2002 薤图 1 紫菜叶状体Fig1ThallusofP.yezoensis图 3 紫菜单孢子放散Fig.3MonostmreRelea.ofP.yezoensis图 5 生长 1 个月的紫菜叶片(40X)Fig.5ThallusofEyezo
17、ensisafterone-monthgrowth(40X)图 2 紫菜多细胞团Fig.2CellMassof,er:oensis图 4 紫菜孢茁F4MonosporeseedlingofP,yezoensis图 6 紫菜原生质体在不 I 司浓度 6_-BA 下的生长状况Fig6GrowthofP.yezoemisprotoplasts1nvoas6 一 BAofdifferentconntratiomA:6-BA(.),C:6-BA(.Oftg/m1).B:6.BA(O.5 咖 1),D:6-B2.og/mO.4 期植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用糖体,加快翻译速度,形成新的蛋白】
18、.NAA 和 6 一 BA 在高等植物组织培养与花卉育种中广泛应用,但在条斑紫菜组织培养中尚未见到相关的正式报道.为了进行紫菜稳定遗传转化研究,试验中只选用了叶片再生率高【巧】的营养细胞部分;本试验发现,添加激素的试验组与对照组相比生长迅速,尤其在生长的中后期,试验组分裂速度明显加快,形成宽大卷曲的棕红色叶片.说明植物激素 NAA 和 6 一 BA 在条斑紫菜的细胞培养中有明显的促分裂,促生长作用,这对于阐明海藻组织的生化控制和生理反应机制意义重大,在今后的紫菜组织培养工作中应该更多地被考虑到.在外源基因转化研究中,必须在培养基中加人一定的选择压力(如一定浓度的抗生素或除草剂等),真正的阳性转
19、化子含有能抵抗外界压力的外源基因表达产物,从而可以存活下来;非转化子则由于无法抵抗外界的胁迫死亡【.因此阳性转化子的筛选工作是转基因研究中最后也是最重要的环节.条斑紫菜原生质体固体培养的成功突破了液体培养的局限性,实现了阳性转化子的定点跟踪观察与定向筛选,为今后的条斑紫菜遗传改良研究奠定了良好基础,同时也为条斑紫菜生长发育过程中相关生理生化机制的研究创造了条件.参考文献:1】ZengCK(曾呈奎),XiangJH(相建海)(1998).MarineBiotechnology.M】Jinan:ShandongPressofScienceandTechnology,8-19(inChinese12
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