1、,乙肝、丙肝与输血,北京大学人民医院 张 正,,触目惊心的事实,血制品筛查 300余万的血清阴性样品，分子生物学复测： HBV：47 HCV：10 HIV-1：2 -2001年剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%-Am. J. Chin Athol. 2000,,上世纪九十年代初丙肝占肝炎10%，几乎全部是血制品引起（单采浆事件）。 本世纪报告因为加强抗-HCV筛查，北京丙肝发病已只占1左右。,触目惊心的事实,,结 论,血制品如果有HBV和HCV污染将成为传播肝炎群发的重要途径，必须严格血筛。以下分乙肝、丙肝介绍。,,HBV感染与检测,1. 病毒结构 5. 免疫检验 2.
2、 临床病程 6. 分子生物学检验 3. 检验依据（05）7. HBV血筛要点 4. 补充共识（08）,,HBV-1 病毒结构模式图,,HBV基因组结构,,HBV增殖过程,,Hepatitis B viral antigens and antibodies detectable in the blood following acute infection.,HBV血清标志物,HBV-2 临床病程,,HBV血清标志物,Hepatitis B viral antigens and antibodies detectable in the blood of a chronically infected
3、 person,,乙型肝炎防治指南（2005）内容,HBV-3 检验依据（05）,,流调情况,我国属HBV感染高流行区，一般人群的HBsAg阳性率为9.09%。 接种与未接种乙型肝炎疫苗人群的HBsAg阳性率分别为4.51%和9.51%()。 我国流行的HBV血清型主要是adrq+和adw2，少数为ayw3 (主要见于新疆、西藏和内蒙古自治区)；基因型主要为C型和B型。(中国肝病协会慢性乙型肝炎防治指南 (2005),,乙型肝炎的临床检验,1、一般检验：血常规 尿常规 生化 2、免疫及分子生物学检验： HBV标志物 3、其它：纤维化指标 肿瘤筛查指标,,HBV-4 补充共识（08）,亚太地区慢
4、性乙肝处理共识（2008）简介,内容 一.引言 二.背景 三.议题和推荐（8个题） （16条推荐建议） 介绍目的：新诊疗方案引发检验新要求,,一、 引 言,自从05.6上版共识后 实践有较大发展1.聚乙二醇干扰素、恩替卡韦、替比呋啶全球批准上市 2.各国（区）新版诊疗方案出现 3.慢性自然史及治疗新资料（列队、随访） 4.基因型、自然变异、耐药处理均有新发现07 泰国讨论；08.3韩国首尔修订,,二 背景,检验要求：生化：ALT AST血清学：乙肝5项HBV-DNA： 直接指导治疗基因型和基因型耐药,,二 背景,2.合并其他病毒感染肝炎（丙、丁）艾滋检验要求：关心新的病毒和合并感染提高对其他病
5、毒的检验能力,,三 议题（8）与推荐（16）,议题：1. 一般处理 （1）2. 治疗适应症 （2-3）3.抗病毒治疗时机 （4）4.药物选择及策略 （5）5.监测 （6-7）6.停药 （8-9）7.特殊处理 （10-16）8.尚需继续研究的问题,,三 议题（8）与推荐（16）,8.问题（6） HBV基因型在哪些方案中必须 口服药应答不满意怎么办？ 儿科策略 慢HDV者的治疗 免疫调节剂模式的作用 每种抗病毒治疗策略成本效益,,三 议题（8）与推荐（16）,检验要求：针对临床工作方案提出检验科配合工作的详细SOP新要求：1.已开展多年的做准，e系统尤其重要2. HBV-DNA稳定，注意定期用标准
6、品质控3. 新项目准备 HBV核酸分型 耐药基因检测,,HBV-5 免疫检验,对血清标志的基本认识,,特异性 敏感性酶标 发光 发光 Anti-C (-) 318 97.78 98.1 100(+) 177 Anti-S (-) 241 93.54 92.8 98.8(+) 239 HBsAg (+) 158 97.66 100 97.4(-) 312 (Nahed Ismail J.C.M. 2004),普通酶标与发光方法特异性和敏感性的比较（见表）,,结 论,1. 免疫学方法检测无论何方法均达不到两个100%。 2. HBsAg、抗HBs、抗HBc在同种方法中有差异。 3. 对HBsAg而
7、言发光特异性好。,,HBV-6 分子生物学检验, 1. HBV-DNA（PCR）2. HBV基因型（与治疗有关）3. 有关耐药,,PCR原理:实质就是体外基因复制技术,加热变性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,,PCR 循环 第一步 加热变性,靶序列,靶序列,从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性1-4分钟，使之解为单链。,,PCR 循环 第二步引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5
8、,3,5,3,3,引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55左右,,PCR 循环 第三步 - 引物延伸,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始, 沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72左右,,第1个PCR循环完成后,靶序列,靶序列,Biotin,Biotin,,30次循环后靶序列扩增的数量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
9、1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,,PCR较CLIA更敏感 对540,161输血血样检测，在一些HBV早期感染中CLIA发现(+)25:1时PCR (+)。（TRANSFUSION p1107）,,HBV-7 HBV
10、血筛要点,1. 免疫学是常规方法 2. 分子生物学提高了敏感性、特异性 3. 感染特点决定了只有两者结合，减少漏检（窗期、特殊感染类型）。,,HCV感染与检测,1. 病毒结构 5. 免疫检验 2. 临床病程 6. 分子生物学检验 3. 检验依据 7. HCV血筛要点 4. 检验进展,,HCV-1 病毒结构,至今尚未培养成功，三维结构不清，使用反义病毒学推出。,,HCV基因结构,,HCV-2 临床病理,,,丙型病毒性肝炎的危害性不容忽视,全球性流行 3% (1.7 亿) 慢性化的危险性 60%85% 临床诊断病例 30% 肝硬化的危险性 在感染后20年内10% 在感染后30年内20% 肝硬化患者
11、中肝细胞癌 1%4%/年 (美国) 的发生率 7% (日本、台湾) 失代偿肝硬化10年存活率 25 肝硬化相关性病死率 1%5%/年,WHO. Hepatitis C. Fact sheet no. 164 Emmet B. Keeffe, MD, Medscape Gastroenterology eJournal, 2002, 4(2) National Institute of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002 Consensu
12、s statements on the prevention and management of hepatitis B and C in the Asia-pacific region,,HCV-3 检验依据（中国）,抗-HCV（免疫学）HCV-RNA （分子生物学）,,HCV-4 检验进展,抗-HCV筛查实验,对于EIA实验（如HCV EIA 2.0和HCV Version 3.0 ELISA）抗-HCV有反应性的标本应进行重复检测，而且重复检测应该为双孔。如果双孔复检中只要有一孔的检测结果为有反应性，则标本被认定为重复有反应性，并可判定为抗-HCV初筛实验阳性。 对于CIA实验（如VIT
13、ROS Anti-HCV assay），抗-HCV单次有反应性的结果即可被判定为初筛实验阳性而不再需要复检 对于EIA和CIA实验，在灰区附近的假阳性比率为15%-60%，因此不能单独依靠初筛实验阳性结果来判断一个人是否感染HCV，因此，初筛实验阳性的标本需应用具有更高特异性的补充确认实验进行确认分析。,,重组免疫印迹分析（RIBA）是具有高特异性的抗-HCV补充确认实验CDC建议对初筛实验阳性的标本，需经RIBA或核酸检测证实RIBA结果表示为“阳性”、“阴性”、“不确定”,血清学补充确认实验结果,,RIBA结果阳性解释,RIBA阳性结果可判定抗-HCV阳性抗-HCV的存在不能区分现症和既往
14、感染确认的抗-HCV阳性结果提示需要进行有关HCV感染的咨询和医学评价，包括进行病毒血症（HCV RNA的NAT检测）和肝病（如ALT）的进一步分析抗-HCV阳性结果确认后，通常不必要进行抗-HCV的重复检测。,,RIBA结果阴性解释,RIBA阴性结果可判定抗-HCV阴性并提示初筛实验假阳性结果，抗-HCV阴性（初筛或RIBA阴性）的个体被认为没有感染由于HCV RNA可以在暴露后的12周可以检出,因此，在感染第一周时可发生抗-HCV检测的假阴性（也就是说，在抗体可检出之前或在血清学转换之中）少数情况下，抗体的血清学转换可以延迟到暴露后几个月才发生.在一些HCV感染后恢复期的人群中，抗-HCV
15、可能会逐渐降低到检测限之下免疫功能低下的HCV感染者抗-HCV会持续阴性，这时，HCV RNA的检测是感染的唯一证据,,RIBA结果不确定解释,RIBA不确定提示不能判定抗-HCV的结果不确定的抗-HCV RIBA结果可见于血清学转换的患者中，偶尔也可发现于HCV的慢性感染者不确定结果也可能提示初筛实验的假阳性结果，这种情况最常见于低危人群的检测结果应收集另一份标本进行抗-HCV的重复检测（1个月）或HCV RNA的检测。,,急性 HCV 感染 （肝脏损伤症状的诊断） 慢性HCV感染（包括对高危、无症状人群的检测） 控制职业感染和围产期感染 治疗检测（治疗前分析、监测疗效） 安全输血及患者术前
16、筛查,进行抗-HCV检测的目的：,HCV-5 免疫检测,,,HCV-6 分子生物学检测,1. HCV-RNA2. HCV基因分型（治疗）,,HCV-RNA 检测方法,1. RNAcDNAPCR扩增2. NASBA技术,,临床标本,核酸提取技术,NASBA 扩增,ECL-化学发光标记检测,NASBA 扩增+分子灯塔检测扩增过程中“分子灯塔” 即时同相检测,方法 1 - NucliSens ECL,方法 2 - NucliSens EasyQ,加入裂解缓冲液和内置标准,NASBA测定原理,,引物 1,逆转录酶,RNase H 引物 2,逆转录酶,T7 RNA 聚合 酶,引物 2,逆转录酶,逆转录酶
17、,RNase H 引物 1,线性循环,扩增循环,NASBA测定原理,,NASBA 和 PCR 的不同,NASBA 扩增目标为RNA 同温扩增 连续扩增 扩增物为单链RNA 引物次序不包含於最终产物中,PCR 扩增目标为DNA 温度循环扩增 循环扩增 扩增物为双链DNA 引物次序包含於最终产物中,,HCV-RNA检测,HCV-RNA 丙肝病毒感染的确证标志 临床中 波动较大病情变化 检测技术问题HCV RNA一次阴性，不能除外HCV感染；也可能提示感染的恢复为了判定HCV感染是否恢复，需经HCV RNA多次检测都是阴性结果的证实，当然，只有血清学抗-HCV检测确认为阳性的患者才有必要进行这种随访
18、。HCV RNA阳性，可与抗-HCV一同报告，证实为活动性HCV感染,,抗-HCV筛查检测,报告,阴性,或,根据S/Co比值判定为阳性,所有阳性结果,高S/Co比值阳性*,报告,低S/Co比值阳性*,RIBA HCV检测,或,阳 性,报告,阴 性,报告,不 确 定,报告,阳性,阴 性,RIBA HCV检测,HCV RNA的NAT检测,阳 性,报告,阴 性,报告,不 确 定,报告,报告,*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。,CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则,,联合应用实际结果,,HCV-7
19、血筛要点,1. HCV检测似较简单实际问题极多。2. 抗HCV的灰区问题时临床难点，由于疾病特点，S/Co值变化较大。,,3. 仪器及多系统开发增加了检验难度， S/Co值：2.1，3.0，3.8，5.0，8.0。 4. HCV-RNA分析前从取样，运送，贮存，核酸提取，核酸贮存，检测多环节均为影响因素。,,5. 抗-HCV与HCV-RNA联合检测及报告模式复杂，说明HCV检测难度大。 6. HCV较HBV临床情况复杂，断续发作易引起漏检，免疫方法与分子生物学共同应用可减少漏检。,,检验质控,1. 做好仪器及试剂性能验证。 2. 做好室内质控（购买，如自制应有详细SOP）随机性。 3. 参加室
20、间质控，随机性。,,4. 以GB22576为基础全面控制人、机、料、法、环各环节，做好实验室全面管理。 5. 重视分析前环节（RNA绝对无菌）,,小 结,,1.无论HBV、HCV均存在窗口期，也有病毒变异影响免疫方法而漏检。 2. 核酸检测敏感，但技术本身存在问题。DNA的污染出现假阳性；RNA的降解引起假阴性。加之HBV变异有HBsAg(-)的乙肝，HCV断续发作RNA不一定持续(+)。,,3. 免疫检测及分子生物学检测单独使用均可造成漏检。血筛与患者生命攸关，应慎之又慎。两种检测同时使用，结果互补，可在目前科技水平下最大程度防止漏检。,,谢谢！,Peking university peoples hospital,
