1、大鼠 PDZ1-FLAG 的亚克隆及 pcDNA3.1载体的构建?382?徐州医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2005,25(5)在长时程增强(LTP), 长时程抑制 (LTD)和突触可塑性活动中都起着重要作用,并在信号转导中相互调节.本研究发现,在培养大鼠海马神经元上,NMDA受体和 AMPA 受体通道活性存在相互抑制现象.Kyrozis 等发现 AMPA 受体与 NMDA 受体在脊髓背根神经元上共定位,而 Bai 等引提出一种非离子依赖性的 NMDA 受体与 AMPA 受体的相互对话.突触后 AMPA 受体的转位现象可能是突触可塑性的主要机制之一,转位过程与
2、胞内 Ca2,Ca2 依赖性蛋白激酶以及突触后致密体蛋白 PSD 一 95,GRIP 等有关,NMDA 受体在这一过程中可能起重要作用“. 相反 ,经由 AMPA 受体或 NMDA 受体内流的 Ca2 可能通过钙一钙调素下调 NMDA 受体活性;胞内升高的 Na 也可能通过 Src 激酶来调控 NMDA受体活性.AMPA 受体与 NMDA 受体的相互抑制现象有重要病理生理意义,可能在一些兴奋性神经递质过度释放的情况下起到神经保护的作用.本实验结果发现,胞外液以 Ba2 代替 Ca.可消除 NMDA受体与 AMPA 受体的相互抑制作用,提示 Ca2 在海马神经元两类谷氨酸受体的相互抑制中起重要作
3、用,其具体作用机制尚待进一步研究.参考文献:234HollmanM,HeinemannS.Clonedutan 城 tereceptorsJ.A|lnRevNeurosci,1994,17:31108.KennedyMB.SignalprocessingmachinesatthepostsynapticdensityJ.Science,2OOO,29o(5492):750754.KyrozlsA,GoldsteinPA,HeathMJ,eta1.Calciumentrythroughasub?populationofAMPAreceptorsdesensitizedneighbonfingNM
4、DAreceptotsinratdorsalhornneuronsJ.JPhysiol,1995,485(2):373381.KennedyMB.Signaltransductionmoleculesattheglutarnate 喈 icposts?ynapticnmbrnneJ.BrainResRev,1998,26(23):243257.5RosenmundC,FehzA,WestbronkGL.Calciumdependentinactiva-tionofsynapticNMDAreceptorsinhippoeampalneuron$JJ.JNeurophysiol,1995,73(
5、1):427430.6YuXM,SalterMW.GaincontrolofNMDAreceptorcurrentsbyintmeeUularsodiumJ.Nature,1998,396(67lO):469474.7JiangQ,GuZ,ZhangG,eta1.Diphosphorylationandinvolvementofextmellularsi 印 alregulatedkinases(ERKI/2)ingIutaf|latein-ducedapoptoticlikedeathinculturedratcorticalneuronsJ.BrainRes,200o,857(12):71
6、77.18JXuTL,DongXP,WangDS.NmethylDaspartateenhancementoftheglycineresponseintheratsacraldorsalcommissuralneuronsJ.EurJNeurosci,200o.12(5):16471653.19JPinillaL,GonzalezIX:,TenaSempereM,eta1.Crosstalkbetweenexcitatoryandinhibitoryaminoacidsintheregulationofgrowthhor-iTlonesecretioninneonatalratsJ.Neuro
7、endocfinology,2001,73(1):6267.1Oj“uF,WanQ,PristupaZB,eta1.Directproteinpeincouplingenablesc1“o6stalkbetweendopamineD5and(一 aminobutyricacidtypeAreceptorsJ.Nature,2000,403(6767):274280.11“Y,Wu【 J,LegeIP,eta1.Asymmetricc 一 inhibitionbetweenGABAAandglycinereceptorsinratspinaldorsalhornneuronsJ.JBiolChe
8、m,2003,278(40):3863738645.12HouXY,ZhangGY,YonJl,eta1.IncreasedtyrosinephosphorylationofalCsubtmJtsofLtypevoltage 一 edcalciumchannelsandinteractionsarrngSrc/Fyn,PSD 一 95andalCinrathippoeampusaftertransientbrainischemiaJ.BrainRes,2003,979(12):4350.【l3JBaiD,MulletRU,RederJC.Nonionotropiecrosstalkbetwen
9、nAMPAandNMDAreceptorsinrodenthippocampalnellrones【JJ.JPhysiol,2002,543(1):2333.1l4jHenleyJM.ProteinsinteractionsimplicatedinAMPAreceptortrY-ticking:acleardestinationando/1improvingroutemapJ.NeurosciRes,2003,45(3):243254.收稿日期:20050730 修回日期:20050902本文编辑:孙立杰大鼠 PDZ1 一 FLAG 的亚克隆及 pcDNA3.1 载体的构建纵艳艳,胡书群,裴冬
10、生,侯筱宇,张光毅(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心,江苏徐州 221002)摘要:目的亚克隆大鼠 PDZ1 一 FLAG 基因片段并构建 pcDNA3.1 载体.方法以pAdTrackCMVPDZ1 为模板,采用 PCR 法获得 PDZ1 一 FLAG 的双链 DNA;与 pcDNA3.1 载体用TdDNA 连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌 JM109 进行筛选,序列测定.结果得到了 PDZ1 一 FLAG 的双链 DNA;酶切鉴定能观察到 PDZ1 一 FLAG 和pcDNA3.1 两条带 ;PDZ1 一 FLAG 测序图谱与文献报道完全一致.结论获得了含目的基因 PDZ1 一 FL
11、AG 的pcDNA3.1 载体 .关键词:PDZ1 一 FLAG;PCR;pcDNA3.1 载体;序列测定中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100o 一 2O65(20o5)05038204基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30330190)作者简介:纵艳艳(1970 一),女,江苏徐州人,实验师,学士.徐州医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2005,25(5)?383?SubcloneofratPDZ1 一 FLAGanditspcDNA3.1vectorconstructionZONGYanyan,HUShuqun,PEIDongsheng,
12、etal(ResearchCenterofBiochemistryandMolecularBiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221(102,China)Abstract:ObjectiveTosubcloneratPDZ1 一FLAGgeneandconstructitspcDNA3.1vector.MethodsUsingpAdTrackCMVPDZ1astemplate.theDNAofPDZ1 一FLAGWasampliedbyPCR.TheDNAWasthenclonedintothevectorpcDNA3.1.andthesequ
13、encewassubsequentlydetermined.ResultsTheDNAofPDZ1WasamplifiedbyPCR.TherecombinantWasshowntocontainthetwobandsofpcDNA3.1andPDZ1 一FLAGbyrestrictionenzymedigestion.ThesequenceofclonedPDZ1 一FLAGWasfoundcompletelyinaccordwiththedescrip6onofthegenebank.ConclusionAiGombinantofpcDNA3.1 一 PDZ1 一 FLAGisobtain
14、ed.KeyWOl:PDZ1 一 FLAG;PCR;pcDNA3.1;sequencePSD 一 95(postsynapticdensity 一 95)是 NMDA,KA受体信号复合体的主要成员.PSD 一 95 家族是膜结合鸟苷酸激酶(membraneassociatedguanylatekinase,MAGUK)家族的亚家族.PSD 一 95 家族的结构特征是:氨基端 3 个 PDZ(PSD 一 95,Dig,Z01)结构域,1个 SH3(Srchomology3)结构域和羧基端无活性的鸟苷酸激酶(GK)结构域.这些结构域可分别介导PSD 一 95 家族蛋白质与特异性蛋白质的相互作用J.
15、PDZ 结构域是 1 个由 90 个氨基酸残基组成的重复序列,又称 GIGF 重复子,可与羧基端一 T/SxV 基元结合 J.正是这 2 个结构域的相互识别介导了 NMDA 受体和 PSD 一 95 的相互作用 4.PSD 一 95 以其氨基端 PDZ1 和 PDZ2 结构域与 NR2亚基羧基端保守基元一 ESxV 结合?,从而将NMDA 受体锚定于突触后膜特定的部位.PSD 一 95 不仅与 NMDA 受体结合,而且还能与KA 受体结合,如 PDZ1 结构域介导 PSD 一 95 与GluR6 受体相互作用 J.GluR6 与 PSD 一 95 结合是通过它的 C 末端残基与 PSD 一 9
16、5PDZ1 或 PDZ1/2 结构域连接的.为了证实过表达 PDZ1 能否抑制 GluR6 与 PSD一95 的结合,本研究以 pAdTmckCMVPDZ1 为原料,通过 PCR 得到其双链 DNA,经酶切回收后,用 LDNA 连接酶将 DNA 连接到 pcDNA3.1 载体上,测序后筛选得到没有发生突变的 pcDNA3.1 一 PDZ1 一FIAG 重组体.1 材料和方法1.1 试剂酚氯仿:异戊醇(25:24:1),氨苄青霉素(ampicillin), 矿物油(mineraloil),低熔点琼脂糖(LMPagamse)为 Sigma 公司产品 .diTes,质粒制备试剂盒,LDNA 连接酶,
17、AccessRTPCRsystem, 限制性内切酶 Hindm,XhoI,为 Pmmega 公司产品.pcDNA3.1 为 INVITROGEN 公司产品.lkbDNAlad.der,琼脂粉,LB 培养基为 GibcoBRL(GrandIsland,NY,USA)公司产品.琼脂糖为 BioRad 公司产品.引物由 GibcoBRL 公司合成.其他常用试剂均为国产分析纯.1.2 菌株大肠杆菌菌株 JM109,由本室保存.1.3PDZ1 一 nAGDNA 的亚克隆1.3.1PCRRTPCR 上游引物为 5AGGCCCAAGCTrATGGACTGTTCTGTAT3;下游为双引物,并引入 FLAG 序
18、列,引物为 5ATCGTCGTCC1TGIIAGTCCCGGCGCATGACATAG3,5GATGAGCIGAGTIA(11TGTCAI GI GICTIPGTAGTC3.浓度为 10tmol/L.取一 0.6mlPCR 管,按一般标准方法加入以下物质:水,10X 反应缓冲液,dNTPs,上游引物,下游引物 1,下游引物 2,TaqDNA 聚合酶,样品模板,总体积 50.混匀管内混合物,滴入 2040 矿物油覆盖表面.将上述反应管放入 PCR 仪,按下列参数进行循环:94oC,2min,1 个循环;94oC,30S,63oC,1min,68oC,1min,35 个循环;68oC,7min,1
19、个循环.反应完毕取出反应管,鉴定片段大小.1.3.2PDZ1 一 FLAGDNA 片段的回收将所获PCR 产物经酚,氯仿纯化后,于 37以内切酶XhoI,Hindm 双酶切过夜.以低熔点琼脂糖法回收DNA 片段.pcDNA3.1 载体酶切后处理同上 .1.3.3PDZlFLAGDNA 与载体的连接和重组DNA 的转化向一个 0.6mlEP 管中按标准方法依次加入试剂:H2O,10Xbuffer,载体,DNA,T4 连接酶,总体积 10.混合后 16或室温保温 16h.取 5l 连接产物,加入 150l 预先制备的感受态细胞 JM109,混匀.冰浴 30min.立即放入 37?384?徐州医学院
20、 ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2005,25(5)水浴 5min.加入预热的 2YT 培养基 450,ul37oC水浴 1h,取 150,ul 涂平板,使其均匀分布于平板表面,在 37c【=培养箱中倒置平板,培养过夜.次日观察有无菌落生长.1.3.4PDZ1 一 FLAG 重组体的鉴定对于通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落,进行小量(5m1)培养后,制备质粒 DNA,用相应的内切酶切割重组子,释放出插入的片段,然后用 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定其相对分子质量.1.3.5PDZ1 一 FLAG 重组体的序列测定将上述电泳鉴定正确的 pcDNA3.1 一 PDZ1 一
21、FLAG 重组体进行测序鉴定.PDZ1 一 FLAG 的序列由上海基康生物技术有限公司利用自动测序仪进行测定.2 结果2.1PCR 产物鉴定以 pAdTmckCMVPDZ1 为模板,进行 PCR,吸取 7tAPCR 产物与 2l 上样缓冲液混匀后,经 1%琼脂糖凝胶电泳分离,结果见图 1,可见一约 471bp 的 DNA 片段.结果提示 PDZ1 一nAG 被成功扩增.2.2 重组质粒的鉴定小量制备所获的质粒经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳显示 2 条 DNA 片段,结果见图 2,一条与 pcDNA3.1 载体碱基数相符,约为图 1PCR 产物的电泳图1.1khDNA 标准样品 2.PCR 产物21
22、21图 2 含 pcDNA3.1 一 PDZ1 一 FlAG 克隆的电泳鉴定1.1kbDNA 标准样品 2.pcDNA3.1 一 PDZ1 一 FlAG 用XhoIandHind酶切产物5.4kb,另一条 DNA 片段(约 471bp)与 PDZ1 一 FLAG碱基数一致.证明 PDZ1 一 FLAG 与 pcDNA3.1 形成重组体.2.3 序列测定经全自动测序,所克隆的 PDZ1 一FLAG 序列与文献报道的 PSD 一 95 的 PDZ1 和 FLAG序列完全一致.结果见图 3.证实了 PDZ1 一 FLAG的 471 个碱基无一突变.cG 口 6 旺Tcnj0 臂 0C 研 CT0K
23、碾 CTGHOG时0caG 册 cMGK 搬cOCTC 冒 GGa10Ga:cGGa:CCCTa:a0O0a.n. .“l1.肌,一 b0TcT00GcTtc0cfcoc.GToGccfGccccGccTcG 口TGcGcocGTccTTtTTTcccGTcTTccTGoTI GGcTGcGccc0G 喁0c0Gcc 口 c250260270780290300310320330340350360.,lv帆虹TCATGACAGCATCCTGITTGTAATGATGGGTTCGGGPGTGACCCATTCAGCTGCGGTGG 描 0cCTCAAGGGcGcTccTcGTTc 口cCTCTATGr
24、CTGCGCCGG3703803904004l0420430440450460470480IIc3r 姚妇nmcfHJ 檬cGcG 腰 G砒 TcTcGCTCTGa:0COCGT 竹,.ccGcTGc0CcTaGTGCCTTCTN;TTGCCACATCTOTTGTTTGCCcToCCCTG4905005105205305405505605705805906v 帆肌枷(佻 k,f,图 3PDZ1 一 FLAG 碱基序列测定图谱,.,PDZ1 时在其后接上融合蛋白 FlAG.另外,由于使用腺病毒作载体,获得能感染真核细胞并表达目的本实验室已构建了 pAdTmckCMVPDZ1 载蛋白的病毒颗粒周期
25、太长 ,所以我们把 PDZ1 一体,并做了大量研究工作.由于 PDZ1 抗体无法购 FLAG 插入到真核表达载体pcDNA3.1 的多克隆位得,而制备过程又非常复杂,所以,本实验在亚克隆点,并将用于在体或离体的实验研究,来观察 PDZ1徐州医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2005,25(5)?385?过表达是否能抑制 GluR6 与 PSD 一 95 的结合.参考文献:1KennedyMB.altranductionmoleculesattheglutamatergiepostsynapt,_cmembraneJ.BrainResRev,1998,26(23):
26、243257.2HataY,TakaiY.Rolesofpostsynapticdensity 一 95/synapsen.ssociatedprotein90anditsinteractingproteinsintheorganizationofsynapsesJ.CellMolLifeSci,1999,56(56):461472.3DoyleDA,LeeA,LewisJ,eta1.Crystalstructuresofacomplexedandpeptidefreemembraneproteinbindingdomain:molecularbasisofpeptiderecognition
27、byPDZJ.ce1l,1996,85(7):10671076.14JNiethammerM,KimE,ShengM.InteractionbetweentheCterminusofNMDAreceptorsubunitsandthemultiplemembersofthePSD 一 95familyofmembraneassociatedguanylatekinasesJ.JNeurosci,1996,16(7):21572163.15JPiserchioA,PellegriniM,MehtaS,eta1.ThePDZ1domainofSAP90.Characterizationofstru
28、ctureandbindinglJJ.JBiolChem,2OO2,277(9):69676973.收稿日期:20050803 修回日期:20050827本文编辑:孙立杰7 一 NI 和 AMT 在脑缺血再灌注中保护作用的比较宋远见,张光毅(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心,江苏徐州 221002)摘要:目的探讨神经型一氧化氮合酶(nNOS)的抑制剂 7 一硝基吲唑(7 一nitroindazole,7 一 NI)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制剂 AMT(2 一 Anlino 一 5,6 一 dihydro 一 6 一 methyl 一4H 一 1.3 一 thiazine)对大鼠脑缺血再灌注后海马 CA1 区细胞的保护作用.方法建立 sD 大鼠全脑缺血动物模型 ,处理组大鼠每
