1、文档下载 免费文档下载http:/ Journal of Ecology 世界生态学, 2013, 2, 38-49Published Online November 2013 (http:/www.hanspub.org/journal/ije.html)Development of Ecotoxicogenomic Biomarkers on the Freshwater Shrimp (Neocaridina denticulate) FollowingShort-Term Exposure to Dipropyl PhthalateYi-Chie Tsai, Hung-Hung Sun
2、g*Department of Microbiology, Soochow University, TaipeiEmail: *hhsungscu.edu.twReceived: Aug. 5th, 2013; revised: Sep. 10th, 2013; accepted: Sep. 26th, 2013Copyright ? 2013 Yi-Chie Tsai, Hung-Hung Sung. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which
3、 permits 文档下载 免费文档下载http:/ use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.Abstract: Phthalate esters (PAEs), which are widely used in industrial chemicals that serve as important additives to impart flexibility to polyvinyl chloride rhttp:/ and have b
4、ecome widely diffused in the environment, are considered to be endocrine disrupting chemicals (EDCs). In order to assess the toxicity of PAE to aquatic crustacean, after shrimps (Neocaridina denticulate) were short-term exposed to a sublethal concentration (50 mg/L) of dipropyl phthalate (DPrP), the
5、 differential expression genes were isolated and identified using suppression subtractive hybridization (SSH) on the samples prepared from the whole individual. There were 71 unique expressed sequence tags (ESTs) which were identi-fied by homology with data-based sequences, including 23 ESTs corresp
6、onded to known genes and 48 ESTs with un-known function. The known genes could be divided into nine classes on the basis of physiological function: genes re-lated to ribosomal, metabolism, immune and structural molecules, concerning the translation-related molecules, in-volved respiration and signal
7、ing, and responding to shttp:/ and vision. By comparing the level of gene transcription in DPrP-treated group vs. non-treated group using semi-quantitative RT-PCR, we found that six of twelve selected genes were significantly up-regulated following exposure to DPrP at high concentration (50 mg/L), i
8、ncluding two im-mune-related genes, one metabolism-related gene and 3 unknown genes. There were eight genes which are significantly responding to DPrP treatment at 1.0 mg/L, including five up-regulated genes (four known genes and one unknown gene) and three down-regulated unknown genes. After exposu
9、re to 0.5 mg/L of DPrP, only four genes (three known genes and one unknown gene) were affected and their mRNA levels increased 文档下载 免费文档下载http:/ These results suggest that N. denticu-late may be harmed via the change of the globally physiological function following exposure in non-lethal PAE-pollute
10、d aquatic environment; in addition, the ESTs derived from N. denthttp:/ can be used for studying the ecotoxicological effect of other pollutants in the aquatic environment.Keywords: Dipropyl Phthalate (Dprp); Endocrine Disrupting Chemical (EDC); Neocaridina denticulate; AquaticCrustacean; Differenti
11、al Gene Expression; Suppression Subtractive Hybridization (SSH)以短暂暴露于邻苯二甲酸二丙酯(Dipropyl Phthalate)之淡水多齿新米虾(Neocaridina denticulata)建立生态毒理基因组生物标志物蔡伊茜，宋宏红*东吴大学微生物学系，台北 Email: *hhsungscu.edu.tw收稿日期：2013 年 8 月 5 日；修回日期：2013 年 9 月 10 日；录用日期：2013 年 9 月 26 日*文档下载 免费文档下载http:/ Open Access摘 要：邻苯二甲酸酯类化合物(phtha
12、late esters; PAEs)是广泛用于塑料制品之塑化剂和造成环境污染甚为可观的內分泌干擾物質。本研究以多齿新米虾(Neocaridina denticulata)暴露于次致死剂量(50 mg/L)之一種 PAE邻苯二甲酸二丙酯(dipropyl phthalate; DPrP)后 1 天，利用抑制性扣减杂交法建立一套基因组指标，探讨其全面基因的表现变化。实验中共筛得 71 个独特的表达序列标签(expressed sequence tages; ESTs)，包括 23 段 ESTs 对应为已知功能基因及 48 段 ESTs 为未知功能。根据生理功能，已知功能基因分别与 9 类相关，包括
13、代谢、呼吸、防御 http:/ DPrP (50 mg/L)时，3 个免疫及代谢相关的基因和 3 个未知功能基因，共 6 个基因的 mRNA 表现量明显下降。暴露于非致死剂量 1.0 mg/L 时，共 8 个基因受到影响，包括正调节的 4 个已知功能和 1 个未知功能基因，以及 3 未知功能基因被负调控。虾子暴露于更低剂量 0.5 mg/L 后，仅 4 个基因受到影响，包括 3 个已知功能和 1 个未知功能基因之 mRNA 表现量明显上升。综合这些结果暗示，包括 DPrP 在內之非致死浓度 PAEs 污染的水域可能藉由影响多齿新米虾的生理功能而威胁其存活；此外，起源自多齿新米虾的 ESTs 也
14、许可用在水生环境中其他污染物之生态毒性效应的研究。关键词：邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)；内分泌干扰物质；多齿新米虾；水生甲壳类；差异表现基因；抑制性扣减杂交法1. 引言内分泌干扰物质(Endocrine disrupting chemicals; EDCs)是人造化学物，常经由食物链进入生物体内形成假性荷尔蒙，使细胞误以为是化学讯号，干扰生物体正常荷尔蒙的合成、分泌、传送及作用，进而影响生物体的代谢、行为、生殖及性别分化等生理作用1。这些外文档下载 免费文档下载http:/ compounds)的化性多安定，在环境中不易被分解，易造成生物累积、生物浓缩及生物转移；对暴露于其中的水生动物往往不具
15、急毒性(acute toxicity)，但会导致慢性中毒而造成组织改变。邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate esters; PAEs)为制造塑料制品需添加的塑化剂，其种繁多且经常于制造过程、使用和丢弃时释出至环境中2，也曾在许多动植物或肉制品中检测出3。在台湾，PAEs 广泛的存在于河水、底泥和土壤中4，并发现其累积在鱼体内5鲑鱼等)具强?之生物浓缩作用，易累积至生物体内之脂肪层，长期下来会造成水中生物遗传因子突变、生物体畸形、生理异常等12,13。目前 PAEs 已被多数国家归类是一种非常普遍存在且优先列管控制的污染物和 EDC。许多无脊椎动物毒性测试议 http:/ 定书常规性地使用
16、在监管毒性测试14。其中淡水甲壳类具有许多优点，包括在许多水域生态系中它们是主要的无脊椎动物、族群个数经常众多且在实验室容易饲养。因此淡水甲壳类目前被推荐用在监测环境污染状况15-17。多齿新米虾(Neocaridina denticulata)简称米虾，广泛分布在台湾水域中，具有许多利于作为监测环境污染的优点，包括体长仅 2 至 3 cm、喜栖息于干净、能自然繁殖、且发育过程缺少变态期(metamorphosis stage)。自 2005 年起，台湾环境保护署宣布米虾为一种急毒性测定的指标生物，以评估各种水体或工厂排放水的质量。然而，目前仅有少数研究是利用米虾以决定农药(如氯化铵，硫酸铜，
17、氯化镉，氯化汞，硫酸锌)的毒性18和氯丹(Chlordane)及灵丹(Lindane)两种 EDCs 对生长和生殖的影响19,20。本研究室曾将米虾浸泡于邻苯二甲酸二丙酯(Dipropyl phthalate；DPrP)后，侦测六种不同的生殖及免疫活性和一种免疫相关基因表现的变化，发现次致死剂量的 DPrP 会提高米虾的易感性(suscep- tibility)21，推测无致死剂量的 PAEs 仍可能对水域生。许多实验发现，PAEs 因水溶性(solubility)和降解文档下载 免费文档下载http:/ 研究指出，当母体内累积过多浓度的动物毒性试验研 PAE 会造成男性胎儿雌性化现象10。究
18、发现，某些 PAEs 对鼠?和大部份哺乳动物具有肝脏和肾脏毒害性11；PAEs 对鱼类(例如虹鳟、大西洋Open Access 39态系造成潜在危机。因此，评估环境中 PAEs 的污染及其毒性是非常重要的。然而针对 PAEs对水生生物全面性生理之影响效应的相关研究极少。近年来，以基因组学(genomics)、转录组学(trans- criptomics)、蛋白质组学(proteomichttp:/ bolomics)等藉由大规模方式以观察生物体内整体变化进行研究的概念逐渐成熟，因为此研究方式能够提供独有的信息。差异性表现基因组的研究适合用于观察生物体内所有基因表现量变化的情形，足以系统性评估生
19、物体所受到的影响。目前常使用的方法之一是抑制性扣减杂交法(suppressive subtractive hybridiza-tion; SSH)，主要原理是将两组样本的 mRNA 反转录成 cDNA 后进行杂合，剩余未杂合的样本即为表现有差异的基因，接着以PCR 放大表现有差异的基因且抑制非目标基因的放大，达到扣减的效果。此方法能筛选出表现量多和极少的基因22。Sung 等以生化指标和基因指标评估不同浓度 DPrP 处理米虾不同时间后的生殖和免疫毒性，发现基因表现对 DPrP 为短期反应且灵敏度优于生化活性21。因此推测米虾的基因组变文档下载 免费文档下载http:/ DPrP 后，建立一套
20、基因组指标，探讨 DPrP 处理后米蝦全面基因的表现变化。实验中，由 DPrP 处理和未处理的两组虾子，利用抑制性扣减杂交法筛选并鉴定出差异表现的基因片段，即表达序列标签(expressed sequence tags; ESTs)；接着，选出数个目标基因，利用 RT-PCR 法确认 DPrP 对米虾生理功能的影响效应，并评估源自米虾的ESTs 未来作为 PAEs 污染指标的可能性。2. 材料方法2.1. 实验用虾及驯养饲养虾子的玻璃缸(30 公分 30 公分 30 公分)底部铺设厚约 3 公分的美细砂，注入养殖池水并装置外挂式过滤器，以过滤打气(150 L/小时)。三日后，放入水草，并外加定
21、时照明设备，水草每日照光八小时。一周后，将购自一般水族馆的健康多齿新米虾(Neocaridina denticulata)放至置备完成的池水中，养殖密度约为每平方公尺 150200 尾，养殖期间每日喂食干燥孑孓一次，驯养三天后才进行实验。402.2. 邻苯二甲酸二丙酯 http:/ phthalate)的制备本研究室过去使用八种 PAEs 实验证明，邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)对淡水长脚大虾(Macrobrachium rosenbergii)免疫力的影响最为明显23；米虾连续暴露于不同剂量 DPrP的 10 天期间，于次致死剂量 50 m/L 处理后 1 天的米虾各项免疫及生殖相关活性反应改
22、变最明显21。因此本研究选择将米虾浸泡于 50 mg/L 之 DPrP，再进行后续实验的探讨。配制药物时，秤取 2500 mg 的 DPrP，溶于 25 mL 的丙酮；再进行十倍稀释，使浓度成为 105 文档下载 免费文档下载http:/ 和 104 mg/L，置于室温下备用。实验前，以丙酮调整浓度为 2 103 mg/L 和 103 mg/L 后，再以养殖水调整 DPrP 浓度为 50 mg/L、1 mg/L 及 0.5 mg/L；接着以三种浓度的池水分别进行后续不同的实验。2.3. 米虾的浸泡处理为了得到讯息传导不同时期的差异表现基因，进行抑制性扣减杂交前，米虾先浸泡于 50 mg/L 的
23、 DPrP 中 2 小时后，再转养至不含 DPrP 养殖池水后 12 小时，进行组织 RNA 的萃取。为决定不同浓度 DPrP 对米虾生理功能的影响，米虾分为三组实验组，分别浸泡于 50 mg/L、1 mg/L 及 0.5 mg/L，对照组米虾则浸泡于不含 DPrP 池水。浸泡一天后，萃取米虾组织 RNA。2.4. RNA 萃取与纯化由于米虾过小，一只虾子难以收集足够的组织以进行实验，所以本实验制备 RNA 样本时，取相同处理后的 10 只米虾为一个样本。以液态氮硏磨虾子后，磨成粉状的组织放入 1 毫升Trizol (Invitrogen, USA)中，室温下作用 5 分钟；接着，加入 0.2
24、 毫升氯仿(chloroform)，剧烈震荡 20 秒，于室温下静置 10 分钟；再于 4下，以转速 12,000 ? g，离心 15 分钟。取最上层溶液，加入 1 毫升异丙醇(isopropanol)，均匀混合；于室温下静置 10 分钟，再以4，离心 15 分钟。去除上清液后，加入 1 毫升 75%酒精，清洗沉淀物，再于 4下，以转速 7500 ? g 离心 5 分钟。倒掉上清液，风干 10 分 http:/ 钟后，取 20 L 之 DEPC 处理过的水以溶解沉淀物，并于55水浴 10 分钟。最后，以核酸计Open Access算仪(GeneQuant II, Phamacia Biotec
25、h, UK)定量 RNA 浓度，当 OD260/280 为 1.82.0 时，利用 mRNA 纯化试剂(Invitrogen)以纯化 mRNA。2.5. 抑制性扣减杂交(suppression subtractive文档下载 免费文档下载http:/ SSH)由实验组和控制组虾子得到的 mRNA 样本后，利用 Clontech PCR-SelectTM cDNA 扣减试剂和根据实验手册进行抑制性扣减杂交(SSH)实验，以建立一个扣减的 cDNA 基因库(library)。主要步骤简述如下。首先进行第一股和第二股 cDNA 的合成，得到双股 cDNA。接着，以 RsaI限制脢切割双股 cDNA
26、两端成钝端(blunt end)，即进行接合子的连结。取 1 L 切割后的DPrP 处理之实验组 cDNA，稀释后分取 2 L 置于两个微量试管中，并分别于第一管加入 2 L 的接合子 adaptor 1，第二管加入 adaptor 2R。在两管分别加入接合酶(T4 DNA Ligase)溶液并混合均匀后，在 16隔夜作用。作用后样本加入 20X EDTA/Glycogen 终止反应，并于72加热 5 分钟，使 ligase 失去活性。实验组样本制备完成后，开始进行杂合反应(Hybridization)，过程中共需进行两次杂合反应。首先，取接合不同接合子的实验组样本各 1.5 L，分别加入等体
27、积经 Rsa I 切割后之对照组 cDNA 样本和 1 L 之杂合缓冲液后，以 98作用 90 秒，接着于 68作用 8 小时，即完成第一次杂合。接着，取切割后对照组cDNA 样本以 98作用 90 秒后，加入第一次杂合的两种不同接合子样本，混合均匀和稍做离心后，以 68隔夜作用。反应后样本加入 200 L 的稀释缓冲液(Clontech)，以 68作用7 分钟后，即得到扣减后的 cDNA。建立扣减 cDNA 基因库前，扣减后 cDNA 需先进行两次的核酸脢连锁反应的放大(PCR Amphttp:/ PCR 引子 1、Taq DNA polymerase、10 mM dNTP mixes 和
28、50 mM MgCl2 以进行放大。第一次放大的 PCR 产物再以巢式 RCR (nested PCR)引子 1 和巢式 PCR 引子 2R，进行第二次PCR 放大。本实验以 -actin 为参考基因(GenBank accession no. AY947402)24，作为扣减过程是否完全的依据。接着，将 PCR产物接合至 pGEM-T TA 质体后，加入胜任细胞文档下载 免费文档下载http:/ AccessEscherischia coli JM109，于 37，转速 225 rpm 下，震荡培养 1.5 小时后，取 100 ?L菌液涂抹培养于含有 X-gal、IPTG 及氨苄青霉素(am
29、picillin; 50 ?g/mL)的 LB 培养基，建立扣减 cDNA 基因库(subtracted cDNA library)。为了检视培养基上的菌落内含有的载体具有外来核酸片段，本实验利用巢式 PCR 引子 1 和巢式 PCR 引子 2R，经 PCR 后，放大产物以 2%琼酯胶体法做确认。另外，藉由限制酶切割图谱分析法以鉴别不同载体是否具有不同外来核酸片段。使用常见三种限制酶 EcoRI、BamHI 和 HimdIII (Biolabs)分别切割质体做，经 1%琼酯胶体电泳即得到的限制酶图谱。图谱片段大小相同者视为同一群。在同一群内随机挑选数个样本，送至阳明基因组中心进行扣减后核酸片段
30、的定序，再以 DNAStar 软件将有部分重复的序列进行前后顺序的排列及重组。重组后序列于 NCBI 数据库分别以 BLASTN 和 BLASTX 进行核酸序列及胺基酸序列的比对。比对时，E 值小于或等于 10?25 者，所得相似序列定义为可信结果。2.6. 半定量 RT-PCR 分析为了再次确认扣减后基因片段与 DPrP 处理的相关性，由比对结果中选出八个已知功能及四个未知功能的 ESTs (表 1)作为分析的目标基因。根据不同 ESTs 序列，设计个别的专一性的引子(表 2)，以半定量反转录 PCR 法分析 DPrP 处理后虾子之不同基因http:/ 的 mRNA 表现量变化。暴露于不同浓
31、度 DPrP 之米虾组织 mRNA 后，加入合成 cDNA 引子，70作用 2 分钟后，加入dNTP 和 RNase 抑制剂(Fermentas)于 37作用 5 分钟；加入反转录酵素(20 units/L; Fermentas)，于 42作用 1 小时，即完成 cDNA 合成，即可进行放大。本实验以 -actin作为内在控制组。放大后产物进行 1%的 DNA 琼酯胶体电泳并照相后，以软件 Image Quant 5.1分析产物条带的吸光强度，以相对吸收单位(relative absorbance units)表示。同一样本中不同目标基因表现量的半定量数值以比值(a ratio)表示，即某目标
32、基因的吸收单位除以同一样本的 -actin 的吸收单位。本研究结果的图表数据则以某基因在实验组的比值除以在控制组的比值表示文档下载 免费文档下载http:/ a ratio of control)。41Table 1. Characteristics of functional EST identified in subtractive libraries from DPrP-treated shrimp表 1. DPrP 处理虾子后得到的扣减基因库中已知功能的表达序列标签性质EST IDGene identified (Accession No.)Function groupsSpecies
33、Length of fragment (bp)E valueRe1 16S rRNA (AY708114.1) 4 Caridina pristis 匙指虾 1425 0 Re2 16S rRNA (DQ463703.2) 4 Chloroflexi bacterium 绿弯菌 312 6.00E-41Re4 Trypsin (X86369.1) 2 Litopenaeus vannamei 南美白虾 766 2.00E-96Re5 Trypsin (AY596945.1) http:/ Neocaridina denticulata sinensis 玫瑰虾 350 3.00E-77Re6C
34、hymotrypsin 1 (X66415.1)文档下载 免费文档下载http:/ vannamei 南美白虾 306 8.00E-33Penaeus monodon 草虾 760 1.00E-63Re12 Re13 Re14 Re17 Re18 Re19 Re20 DPrP1 DPrP9 DPrP10Opsin (Rh) gene (DQ852595.1) Sarcoplasmic calcium-binding protein (SCP1)(DQ256199.1) Calcified cuticle protein (DQ288151.1)5 6 7Neomysis americana 黑
35、褐新糠美洲虾 326 2.00E-92Procambarus clarkii 克氏原螯虾 645 1.00E-78Callinectes sapidus 蓝蟹 608 4.00E-27Litopenaeus stylirostris 西方蓝虾 794 2.00E-59N. denticulata sinensis 玫瑰虾 693 9.00E-73Paralithodes camtschaticus 石蟹 364 2.00E-42Metapenaeus ensis 刀额新对虾 466 7.00E-36Dictyostelium discoideum 黏菌 846 8.00E-32Mitochon
36、drial COI gene for cytochrome oxidasesubunit I (AB300187.1) Collagenolytic serine protease (AF461035.1) Chromosome 4 (NW001263854.1)4 7 2 9QM protein (EU004069.1) 3 Marshttp:/ japonicus 日本对虾 398 1.00E-文档下载 免费文档下载http:/ carboxykinase2Nephrops norvegicus 挪威龙虾 259 3.00E-43L. vannamei 南美白虾612 1.00E-69DP
37、rP15 DPrP16 DPrP21 DPrP24 DPrP27 DPrP31Myosin light chain (HM034314.1) Mitochondrial cytochrome oxidase subunit 2(COII) (AY842663.1)Preamylase 1 (X77318.1) ribosomal protein 4 (AY829788.1) ribosomal protein L8 (DQ316258.1) S2 ribosomal protein (AY292479.1)7 4 2 1 1 1Penaeus monodon 草虾 507 5.00E-37He
38、mipyrellia ligurriens 瘦叶带绿蝇 270 5.00E-47L. vannamei 南美白虾 251 8.00E-32Lonomia oblique 天蚕蛾幼虫 254 4.00E-42L. vannamei 南美白虾 236 7.00E-64Eleginus gracilis 红花鳕鱼125 5.00E-30The number in the third column indicates functional groups. 1: Ribosomal, 2: Metabolism, 3: Immune response, 4: Respiration, 5: Vision
39、, 6: Signaling, 7: 文档下载 免费文档下载http:/ 8:Translation, 9: Chromosome.:/ 统计分析由于米虾非纯品系(outbred)动物，个体之间表现型背景的差异性大，所以每一相对数值至少进行 5 重复，每一重复至少使用 5 只虾子。以 one-way ANOVA 和 Duncan 进行不同浓度处理组之间的比较，分析后有显着差异者(P 因，本研究由实验组及控制组的虾子，利用抑制性扣减杂交法后，针对所有转型株，利用巢式 PCR 确认后，筛选获得 431 个转型株。进一步确认插入之基因片段是否相同，以三种限制酶 EcoRI、BamHI 和 Himd进
40、行切割，以分析各 cDNA 的限制图谱后，共挑选得 226 个转型株，即得到一个扣减后 cDNA 基因库。3. 结果3.1. 差异表现片段的扣减基因库(subtractedcDNA library)的建立为了得到 DPrP 处理前后具有差异异性表现之基423.2. 基因片段的比对基因库所有基因片段定经序后，以 DNAStar 软件将不同片段序列上重复的部分进行前后顺序文档下载 免费文档下载http:/ 71 个独特的表达序列标签(expressed sequence tages; ESTs)。接着，利用 NCBIOpen AccessTable 2. The specific primers
41、of ESTs used in this study 表 2. 使用在本研究之表达序列标签的专一性引子序列 EST ID Sequence for primers (5?3) Size (bp) Re9 L:CAGCCCAAATGTCCGTTACT R:CCTTGAAGCTTGGCACATC 600 Re17 L:CGTGAGCACGTCTTGCTTT R:TGAGCAGTGTGGCAGTCAA 701 Re18 L:GGCTCGTGTGTCAACATCC R:CCCCCATTAGCAAGAGGAA 522R20 L:CTTCAACCCAGCCAATGTG R:GGTAGCAATGhttp:/
42、 337DPrP9 L:GCC TTGTTACGGTCGTGAGT R:GGGAAGAAAGAAGGCTGACG 330 DPrP10 L:CTCATGTCCCAGAAACCAA R:CCCAGGTAAAGAAGGAGTCA 248 DPrP11 L:CACACCTCGCGGGTAGTAGT R:ACCAAGCTGCTGCTTCAAA 510 DPrP15 L:CCTCCAGGTCTTCTGGTGAG R:GAAGCGCTTGAGTGTCACAG 375 uDPrP4 L:ATGTCGAGTGCCAGCTCAG R:GTGTTGGCAGTGACGACTCA 315 uDPrP12 L:CTTC
43、AGCAACTGCAAGTCCA R:GCATGACTGTGAGGGCTTTT 356 uDPrP13 L:CACTAGGCGAGTTAAGGATG R:GTTTCCTTTATGGTGCGAGT 254 uDPrP14L:GCCGATGTCACGGATAAGTC R:GGAGTCTGT GCCCAAGTCAT304EST, expressed sequence tag; uDPrP denotes ESTs had not be identified in thepublic databases and are regarded as function unknown genes.文档下载 免
44、费文档下载http:/ BLASTN 和 BLASTX 分别进行核酸序列及胺基酸序列的比对，将其中核酸序列比对所得之 E值低于(或等于)10?25 且比对到的物种为无脊椎动物之基因片段，定义为已知生理功能；比对后得到 23 段 ESTs 对应为已知功能基因(表 1)及 48 段 ESTs 为未知功能。已知功能 ESTs大致可分与九类生理功能相关，包括：核糖体组成的核糖体蛋白(ribosomal proteins；DPrP24, DPrP27 及 DPrP31)；代谢相关基因的胰蛋白酶(trypsin;Re4 及 Re5)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin; Rhttp:/ DPrP21)、溶脢体组织蛋白脢(cathepsin-L
