1、1银杏雌雄株性别鉴别的研究进展姓名：程勤贤 学号：03234 导师：陈鹏单位：扬州大学 地址：农学院园艺系 邮编：225009摘要：本文综述了银杏雌雄株特性及性别鉴别方面的研究,将其概括为形态学、生理生化、同工酶、分子标记等几个方面。通过形态特征来鉴别银杏雌雄株性别，相对比较简单易行；生理生化指标在已知性别的成年植株之间进行分析测定，结果存在着一定的差异性；染色体形态特征是进行银杏雌雄性别鉴定的重要方法之一，也是最直接的遗传学证据；用同工酶谱进行银杏雌雄株性别鉴定研究，同样具有一定的效果，但这2 种方法要求较高，比较烦琐。特异蛋白质技术和分子生物学技术是近年来发展起来的鉴别植物雌雄株性别的新技
2、术新方法，具有相对准确可靠的特点，在银杏雌雄株性别的鉴定上应用行之有效。关键词：银杏；性别鉴定；研究进展银杏雌雄异株,实生苗定植后一般需要 2030 年才能开花结果,分出雌雄。由于银杏种子在成熟时具有一种特殊的臭味,因此,城市绿化需要雄株,而以生产白果为目的的银杏栽培主要需要雌株。因此银杏实生幼苗的性别早期鉴定,不仅具有理论意义,同时也具有实用价值。国内外学者曾在其形态学、生理生化指标、同工酶谱、染色体核型和分子标记鉴定等方面进行了研究,现分别综述如下,为进一步研究、开发和利用银杏这一珍贵资源提供依据和参考。1. 形态学鉴定研究外观形态 雄株 雌株种籽 种籽具尖头三棱 种籽近圆形二棱苗期 侧枝
3、与主干间夹角内有一较大的叶片 侧枝与主干间夹角内无叶片树冠同龄树植株高大，形成树冠时间早,枝多而乱,呈广卵圆形同龄树植株矮小叶片 叶片大,锯齿缺刻深 叶小,叶端多为浅裂花 雄花序为柔荑状花序,外形似桑椹 雌花长在花梗顶端,分作两叉,外形如火柴梗花芽 雄花芽大而饱满,顶部稍平 雌花芽瘦而稍尖树枝成龄树,雄株主枝与主干夹角较小,多在 30 度左右较挺直,生长势强,短枝较短,一般仅 1-2 厘米雌株主枝与主干的夹角大,可达 50 度,向四周扩展,生长势弱,短果枝因连年结果,枝条延伸较长,可达 10 厘米物候期 雄株比雌株发芽早、落叶迟2虽然凭外部形态特征来鉴别银杏性别,方法简单易行,但要等植株达到一
4、定年龄,一定大小,因而“早期鉴定”存在一定难度,而且形质指标差距甚大,缺少数字化和图谱的明确标准,易发生讹谬。2. 生理生化研究许多的研究表明,雌雄的代谢差异集中表现在氧化还原能力方面。一般说来,雌性器官或个体处于较还原状态,而雄性的处于相对氧化状态。赵云云等对银杏雌雄株氨基酸组分及含量进行了研究,发现银杏雌雄株的氨基酸平均含量有差异,雄株高于雌株,其中胱氨酸和酪氨酸含量较为突出。对银杏雌雄株的代谢差异检测发现雌雄株叶绿素和维生素 C 的含量有差异。以高效液相色谱(HPLC)法分析银杏树种中酸性醇溶性酚类物质的结果表明,不同性别的植株之间存在明显的性别相关峰,这些树种叶片水溶性酚类物质总量的测
5、定结果是雌株普遍高于雄株,经检验这种差异达到极显著水平。王双明等分别对两种不同树龄的雌雄银杏植株叶片进行了多项生理生化的比较分析,结果表明（表 1，2 ）:雄株叶片的叶绿素、可溶性糖、蛋白质含量及 CAT、POD 活性均大于雌株叶片。这表明不同性别的银杏叶片在一系列生理生化特性上均存在较明显的差异。注：样品 1 为 9 年生雄株;样品 2 为 9 年生雌株;样品 3 为 4 年生雄株;样品 4 为 4 年生雌株。王白坡等分析了银杏雌雄株芽尖及叶片中内源激素含量,结果表明（图 1）,在整个生长季节雌株芽尖中 GA3和 ZT 的平均含量比雄株高 20%以上;而 IAA 和 ABA 相反,雄株高于雌
6、株,证实了成年银杏不同性别间内源激素水平存在着一定差异,但未对幼龄银杏实生树进行系统研究。3图 1 银杏生长期内源激素含量变化蔡汝等作了银杏雌雄株叶片光合特性、蒸腾速率及产量的比较研究,结果表明（表3、4、5） ,银杏雌雄株叶片的光合能力、蒸腾速率及构成叶片产量的部分因子存在明显差异。银杏雄株叶片光合速率高于雌株 15.19%20.88%,蒸腾速率高于雌株41.91%52.92%,雄株的叶面积与鲜质量均高于雌株。除此之外,对一些雌雄异株植物还进行了胡萝卜素含量和呼吸强度等生理指标比较研究,发现雌雄株之间存在一定的差异性。表 3 银杏雌雄株的净光合速率单位:mol(CO2)/(m2s)4表 4
7、银杏雌雄株蒸腾速率单位:mmol(H2O)/(m2s)表 5 银杏雌、雄株叶片性状比较 但以上生理生化指标大多力求从不同侧面寻找已知性别的成年植株之间进行测定,表现出一定的差异性,尽管有些差异在苗期也有反映,但多表现在量的方面,能否用于苗木早期性别鉴定有待于进一步研究。3. 染色体核型研究染色体形态特征是进行银杏雌雄性别鉴定的重要方法之一,也是最直接的遗传学证据。国内外有关银杏染色体组成及性染色体的研究已有报道。Tanaka 等描述了叶片的染色体组成,并发现第 1 对大染色体的短臂上及第 8 对染色体的长臂上有随体,但没有报道性染色体存在的证据。Newcomer 通过观察发现大染色体存在二型性
8、,在大约一半的小孢子中表现为中部着丝粒染色体,而在另一半小孢子中出现次中部着丝粒染色体,推测这种二型染色体与银杏的性别决定有关。C.L.Lee(李正理)及 Pollock 的研究结果表明,银杏雌雄株的染色体具有形态上的不同,雌株 4 条染色体上有随体,而雄株只有 3 条染色体上有随体。在雄株中的 1 对最短的次端部着丝粒染色体中,只有其中的 1 条染色体上出现随体,因此认为这 1 对染色体即为性染色体,并提出银杏的性别决定机制属型,雌株为型,雄株为型。这与陈瑞阳认为银杏的性别决定机制属型,雄株为型,雌株为型的结论不尽一致。陈学森等研究表明(图 2，表 6),银杏雌雄株染色体数目及核型一致,唯一
9、区别是雌株 4 条染色体上有随体,而雄株仅有 3 条染色体上有随体,与李正理的结论完全一致,因此他认为第 10 对亚中部着丝粒染色体可能为性染色体,并给出了银杏雌雄株的核型为 2n=2x=24=4m(2sat)+8sm(2sat)+12st。第1、2 对为具中部着丝粒染色体，其中第 1 对大染色体的短臂上各有一个随体；第4、8、9、10 对为具亚中部着丝粒染色体，其中第 10 对染色体的长臂上仅一条染色体具随体；第 3、5、6、7、11、12 对为具亚端部着丝粒染色体，最长染色体与最短染色5体之比为 2.07，属 3B 型，相对长度在 6.72%13.88%之间。图 2 银杏雄、雌株核型 表
10、6 银杏雌雄株染色体的相对长度、臂比和类型4. 同工酶谱研究钟诲文等经过 4对 2 株已知雌雄性别的银杏采用不同提取液提取、不同电泳方法和不同的显色方法进行鉴定,所得的过氧化物酶图谱基本相同,雌雄株间存在有规律性的差异,即雌株幼叶较雄株有较多的过氧化物酶区带,并利用这一区带对 12 株已知性别的银杏植株进行了过氧化物同工酶的普查,显示出与定点观察同样的结果,在对 9 株未知性别的银杏植株进行鉴定中,取得了与雌雄株一致的 2 种类型的过氧化物同工酶的图谱,从而说明了银杏苗木之间过氧化物同工酶的差异,可能成为银杏性别鉴定的生理生化指标。四川林业科学研究所种源组分析了银杏中的过氧化物同工酶,结果表明
11、,雄株6酶谱带具有 1 条活性强的和 1 条活性弱的;而雌株具有 3 条活性中等和 2 条活性弱的,二者差异明显。杜希华等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对已知性别的银杏成年大树(树龄 40 年以上)、在形态上尚未分化出雌雄的实生苗(苗龄 23 年)、实生幼苗(苗龄40 天)以及雌雄树叶诱导的愈伤组织进行过氧化物酶同工酶的测定（表 7） ，发现成年树雌雄株的酶谱存在着差异,雌株较雄株有较多的酶带,且有两条酶带的电泳迁移率相同,但活性不同。实生苗和实生幼苗酶带比成树的明显减少,且在不同株中的活性趋于相同。而对已知性别成年树叶片诱导的愈伤组织进行检测,其酶谱与成树、实生苗和实生幼苗的明显不同,但均出现
12、了雌雄成树共同具有一条酶带,且活性极强。上述酶带差异不一定是雌雄性别造成的,有可能与其他性状的变异有关,诸如叶片性状等,这些变异在银杏雌雄株内普遍存在,且由于在早期鉴定时,可选择的酶种类较少,显色的酶带不多,有时并不能区分开雌雄株。表 7 银杏过氧化物同工酶相对泳动率5. 分子生物学研究80 年代发展起来的分子标记技术是一组可以检测出大量 DNA 位点差异性的分子生物学技术,它是在遗传信息的载体DNA 水平上研究不同生物个体间的差异,不受环境条件、发育阶段、不同器官和组织的影响,而且基因组 DNA 的变异非常丰富,分子标记的数目几乎是无限的。目前用于植物种质资源研究的分子遗传标记技术主要有两大
13、类:一类是以分子杂交为基础的限制性片段长度多态性(RFLP);另一类是以聚合酶链式反应(PCR)为基础的标记,包括随机扩增多态性 DNA (RAPD),微卫星（SSR）,锚定微卫星（ISSR）和扩增片段长度多态性(AFLP)等。王晓梅等应用 RAPD 技术，通过 300 个随机单引物及 200 对随机双引物组合，检测雌雄异株银杏基因组 DNA 的多态性，结论为雌雄基因组间的相似性为 99.98%，仅获得 1 个与银杏雄性基因组相关的 RAPD 标记，其引物序列为 TGATCCCTGG。姜凌等也利用 RAPD 技术寻找银杏中与性别相关的分子标记，得出一条大小为 682bp、雄性特异的分子标记。黄
14、代青等采用玻璃针分离法,通过显微操作系统成功地分离了随体较为明显的那条第 1 染色体。并将分离到的单条染色体去蛋白,Sau3A 酶切,并在染色体 DNA 片段两端加上 Sau3A 人工接头,进行 2 轮 PCR 扩增,得到了大小为 300-3000bp 的扩增片段。用第 2 轮 PCR 产物构建质粒文库,得到了约含有775000 个重组子的该染色体 DNA 文库。随机挑取 66 个重组子进行分析,发现插入片段大小主要分布在 500-2000bp,平均为 800bp。该文库为银杏第 1 染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆以及性染色体的鉴别等研究提供了基础。银杏雌雄株之间的差异归
15、根结底是 DNA 分子之间的差异,利用分子标记在 DNA 分子水平上去研究雌雄株之间的差异性,从中找到鉴别雌雄株的特异性 DNA 片段,对此进行测序,进而制备 DNA 探针或试剂盒,使得人们在幼苗期就能够对银杏雌雄株的性别进行鉴定。随着分子生物学技术的日益发展,分子生物学鉴定已成为一种可靠的鉴别途径,也可能是最终解决银杏雌雄株鉴定的最好方法。参考文献1. 谭晓风,胡芳名,张启发.银杏主要栽培品种的分子鉴别.中南林学院学报,1998,18(3):3-9.2. 陈中海,陈晓静.雌雄异株果树的性别决定及性别鉴定的研究进展.福建农业大学学报,2000,29(4):429-434.3. 刘叔青,郑俊华.
16、果德安,等.展望分子生物学技术在银杏研究中的应用.国外医药植物药分册,1999,14(1):4-6.4. 陈学森,邓秀新,章文才.中国银杏品种资源染色体数目及核型研究初报.华中农业大学学报,1996,15(6):590-593.5. 陈学森,章文才,董会.中国银杏研究进展(一).山东农业大学学报,1998,29(3):415-418.6. 陈学森,邓秀新,章文才.银杏雌雄株核型及性别早期鉴定.果树科学,1997,14(2):87-90.7. 钟海文,杨中汉,朱广廉.根据过氧化物酶同工酶图谱鉴定银杏植物的性别.林业科学,1982,18(1):1-4.8. 赵云云,刘捷平.雌雄异株植物的生理生化特性及性别鉴定.北京师范学院学报(自然科学版),1991,12(4):27-33.9. 陈瑞阳,宁文芹,李秀兰.银杏性染色体研究.郑德明.全国首届银杏学术讨论会论文集.武汉:湖北科学技术出版社,982.21-29.10. 蔡汝,陶俊,陈鹏.银杏雌雄株叶片光合特性、蒸腾速率及产量的比较研究.落叶果树,2000,32(1):14-16.
