1、文 章 编 号 ： 1000-7423（ 2005） -04-0240-03【 实 验 报 道 】吉 曼 尼 兹 （Gimenez） 染 色 法 快 速 筛 选阿 米 巴 滋 养 体 内 嗜 肺 军 团 菌沈 洁 ， 姜 庆 五 ， 李 勤 学 ， 陈 洪 友 ， 李 子 华【 摘 要 】 目 的 寻 找 简 便 、 有 效 的 染 色 方 法 ， 用 于 快 速 筛 选 阿 米 巴 滋 养 体 内 嗜 肺 军 团 菌 。 方 法 嗜 肺 军 团 菌（ Legionella pneumophila） 与 多 噬 棘 阿 米 巴 （ Acanthamoeba polyphaga） 共 培 养 ，
2、 取 不 同 时 点 的 共 培 养 物 制 作 涂 片 ， 采 用 革兰 氏 染 色 、 吉 曼 尼 兹 （ Gimenez） 染 色 、 姬 姆 萨 （ Giemsa） 染 色 、 免 疫 荧 光 染 色 等 多 种 方 法 ， 用 光 学 显 微 镜 及 荧 光 显 微镜 观 察 鉴 别 阿 米 巴 滋 养 体 与 其 胞 内 嗜 肺 军 团 菌 ， 并 比 较 这 些 染 色 方 法 的 效 果 。 结 果 Gimenez 染 色 方 法 效 果 较 好 。 虫体 呈 蓝 色 、 嗜 肺 军 团 菌 呈 红 色 ， 两 色 分 明 。 在 共 培 养 初 期 即 可 观 察 到 阿 米
3、 巴 滋 养 体 胞 内 少 量 的 杆 状 嗜 肺 军 团 菌 。 本 法灵 敏 度 高 ， 省 时 、 耗 材 少 ， 操 作 简 便 。 结 论 Gimenez 染 色 对 阿 米 巴 滋 养 体 胞 内 嗜 肺 军 团 菌 形 态 学 检 测 具 有 实 用 价值 ， 适 合 于 实 验 室 检 测 和 临 床 诊 断 应 用 。【 关 键 词 】 吉 曼 尼 兹 染 色 ； 染 色 与 标 记 ； 阿 米 巴 滋 养 体 ； 嗜 肺 军 团 病 杆 菌中 图 分 类 号 ： R382.1 文 献 标 识 码 ： AGimenez Staining： A Rapid Method fo
4、r Initial Identification ofLegionella pneumophila in Amoeba TrophozoiteSHEN Jie， JIANG Qing-wu， LI Qing-xue， CHEN Hong-you， LI Zi-hua（ School of Public Health， Fudan University， Shanghai 200032， China）【 Abstract】 Objective To establish a rapid staining method for facilitating initial identification
5、of Legionella pneumophila inamoebal trophozoite. Methods Acanthamoeba polyphaga and Legionella pneumophila were co-cultured under laboratory condition.At consecutive time points during the culture， smears of the cultured products were made on glass slides for staining purposes. Differenttypes of sta
6、inings including Grams staining， Gimenez staining， Giemsa staining and immunofluorescence were used to determine the bestmethod for the identification of amoebal pathogens. Results Gimenez staining technique is simpler and yields better results as com-pared with the other three stainings. Gimenez st
7、ain gives the best color and contrast for amoeba and amoebal Legionella Amoeba tropho-zoites and/ or cysts showed a distinct purplish blue with amoebal Legionella in red. Amoebal Legionella can be distinguished clearly at anearlier time of co-culture， providing a proper sensitivity. It takes only 10
8、 minutes to finish the operation. The other techniques requirethe use of expensive reagents， are relatively time-consuming， and involve complex staining procedures. Conclusion Gimenezstaining is of value for the initial identification of amoebal pathogens， and it is suitable for laboratory diagnosis
9、.【 Key words】 Gimenez staining； Staining and IabeIing； Amoeba trophozoite； Legione/a pneumophi/a作 者 单 位 ： 复 旦 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 学 教 研 室 ， 上 海 2000321980 年 首 次 发 现 嗜 肺 军 团 菌 （ Legionella pneu-mophila） 能 在 自 由 生 活 阿 米 巴 （ FLA） 滋 养 体 中 生 存 、繁 殖 1。 已 发 现 的 阿 米 巴 滋 养 体 胞 内 共 生 菌 及 寄 生菌 ， 有 军 团 菌 样 阿
10、米 巴 致 病 菌 （ Legionella-like amoebalpathogens， LLAPs ） 1-15 型 、 衣 原 体 样 胞 内 菌（ Chlamydia-like endosymbionts） 、 鸟 分 枝 杆 菌 （ My-cobacterium avium） 、 李 斯 特 单 核 细 胞 菌 （ Listeria mono-cytogenes） 、 野 兔 热 弗 郎 西 丝 菌 （ Francisella tularensis） 、新 型 隐 球 菌 （ Cryptococcus neoformans） 等 ， 以 及 一 些病 毒 ， 如 巨 病 毒 （ gi
11、ant minivirus） 2-7。 阿 米 巴 滋 养 体内 嗜 肺 军 团 菌 样 品 主 要 是 通 过 与 阿 米 巴 滋 养 体 共 培养 、 分 离 获 得 。 由 于 嗜 肺 军 团 菌 形 态 较 大 ， 进 入 阿 米巴 滋 养 体 后 用 常 规 染 色 、 光 学 显 微 镜 （ 油 镜 ） 观 察 ，不 能 准 确 区 分 两 者 结 构 ， 必 须 通 过 电 镜 观 察 其 形 态 。作 者 采 用 革 兰 氏 染 色 、 吉 曼 尼 兹 （ Gimenez） 染 色 、 姬姆 萨 （ Giemsa） 染 色 、 免 疫 荧 光 染 色 等 多 种 方 法 ， 观
12、察 了 阿 米 巴 滋 养 体 内 嗜 肺 军 团 菌 ， 以 寻 找 一 种 快 速 、有 效 的 检 测 阿 米 巴 滋 养 体 胞 内 菌 的 方 法 。材 料 与 方 法1 材 料嗜 肺 军 团 菌 由 本 实 验 室 保 存 ， 多 噬 棘 阿 米 巴 为 美国 American Type Culture Collection 公 司 产 品 。 军 团 菌 属特 异 性 免 疫 荧 光 抗 体 染 液 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC）标 记 为 美 国 Sigma 公 司 产 品 ， 蛋 白 胨 为 美 国 Difco公 司 产 品 ， 酵 母 浸 液 为 美 国 Dif
13、co 公 司 产 品 。 复 红 、042 中 国 寄 生 虫 学 与 寄 生 虫 病 杂 志 2005 年 8 月 第 23 卷 第 4 期 Chin J Parasitol Parasit Dis Aug.2005， Vol.23， No.4孔 雀 绿 、 结 晶 紫 、 碘 、 碘 化 钾 、 甲 醇 （ 100%） 、 乙 醇（ 95%） 、 葡 萄 糖 均 为 国 产 分 析 纯 。2 嗜 肺 军 团 菌 与 多 噬 棘 阿 米 巴 共 培 养多 噬 棘 阿 米 巴 在 712 蛋 白 胨 酵 母 肉 汤 （ peptone-yeast-glucose broth， PYB712）
14、培 养 基 蛋 白 胨 （ difco0118） 20.0 g， 酵 母 浸 液 （ difco 0127） 1.0 g， 葡 萄 糖18.0 g 中 25 培 养 1 2 d， 至 阿 米 巴 滋 养 体 单 层 铺满 培 养 瓶 底 部 ， 滴 入 1 2 ml 嗜 肺 军 团 菌 悬 液 （ 浓 度约 为 109） ， 25 共 培 养 1、 2 及 3 d 后 ， 吸 除 上 层 液体 ， 用 阿 米 巴 生 理 盐 水 （ amoebal saline， AS） NaCl120 mg， MgSO44 mg， CaCl24 mg， Na2HPO4142 mg，KH2PO4136 mg
15、重 悬 贴 壁 的 阿 米 巴 滋 养 体 和 （ 或 ）包 囊 制 成 涂 片 。3 革 兰 氏 染 色涂 片 经 火 焰 固 定 ， 结 晶 紫 染 液 染 色 1 min 后 冲洗 ， 碘 液 碘 5 g， 碘 化 钾 10 g 染 色 1 min 后 冲 洗 ，乙 醇 脱 色 30 s， 冲 洗 后 用 复 红 染 液 复 染 1 min， 冲 洗 ，晾 干 。4 Gimenez 染 色涂 片 经 甲 醇 固 定 ， 用 新 鲜 配 制 的 复 红 染 液（ 37 预 热 48 h） 染 色 5 min， 冲 洗 后 用 0.8% 孔 雀 绿染 液 染 色 1 min， 至 阿 米 巴
16、 呈 现 蓝 绿 色 ， 冲 洗 ， 晾 干后 再 用 0.8% 孔 雀 绿 染 液 复 染 1 min， 晾 干 。5 Giemsa 染 色涂 片 用 甲 醇 固 定 ， 滴 加 10 倍 稀 释 的 Giemsa 染 液 ，30 min 后 冲 洗 ， 晾 干 。6 免 疫 荧 光 染 色涂 片 用 丙 酮 （ - 20 预 冷 ） 固 定 5 min， 滴 加 20倍 稀 释 的 军 团 菌 属 特 异 性 免 疫 荧 光 抗 体 染 液 ， 37 水 浴 中 避 光 孵 育 30 min， 用 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 （ PBS）（ pH 8.0） 冲 洗 后 观 察 湿 片 。7
17、 显 微 镜 观 察前 4 种 染 色 涂 片 用 Olympus 光 学 显 微 镜 （ 1 000） 观 察 ， 免 疫 荧 光 染 色 涂 片 用 Olympus 荧 光 显 微镜 （ 1 000） 观 察 。结 果1 Gimenez 染 色阿 米 巴 滋 养 体 呈 蓝 绿 色 ， 嗜 肺 军 团 菌 呈 红 色 ， 两种 颜 色 清 晰 。 嗜 肺 军 团 菌 为 细 杆 状 ， 长 短 不 一 。 共 培养 初 期 为 短 杆 状 、 数 量 较 少 ， 阿 米 巴 滋 养 体 空 泡 或 胞浆 中 仅 以 单 个 或 二 三 个 分 布 。 共 培 养 后 期 ， 嗜 肺 军 团
18、菌 数 量 明 显 增 多 ， 红 色 ， 形 态 各 异 ， 呈 短 杆 状 ， 充 满整 个 阿 米 巴 滋 养 体 空 泡 和 （ 或 ） 胞 浆 ， 或 呈 长 杆 状 分布 于 胞 浆 中 ， 或 呈 短 杆 、 长 杆 混 合 分 布 于 空 泡 和（ 或 ） 胞 浆 中 （ 图 1） 。2 革 兰 氏 染 色阿 米 巴 滋 养 体 呈 革 兰 氏 阴 性 的 红 色 ， 共 培 养 各 时间 段 均 分 辨 不 出 阿 米 巴 滋 养 体 与 嗜 肺 军 团 菌 。3 Giemsa 染 色阿 米 巴 滋 养 体 呈 浅 蓝 色 ， 核 和 空 泡 明 显 ， 嗜 肺 军团 菌 呈
19、 深 蓝 色 ， 颜 色 对 比 度 相 对 较 差 （ 图 2） 。 共 培养 初 期 ， 菌 量 较 少 ， 难 分 辨 。 共 培 养 后 期 大 量 菌 体 进入 阿 米 巴 滋 养 体 并 有 增 殖 ， 可 见 嗜 肺 军 团 菌 呈 杆 状 ，长 短 不 一 ， 多 数 重 叠 ， 染 色 较 深 ， 分 布 于 阿 米 巴 滋 养体 空 泡 和 （ 或 ） 胞 浆 中 ， 分 色 相 对 较 差 。4 免 疫 荧 光 染 色共 培 养 初 期 ， 阿 米 巴 滋 养 体 与 胞 内 嗜 肺 军 团 菌 较难 分 辨 。 共 培 养 后 期 ， 阿 米 巴 滋 养 体 呈 现 非
20、 特 异 性 的黄 绿 色 ， 着 色 较 暗 ， 而 胞 内 嗜 肺 军 团 菌 呈 现 特 异 性 的亮 绿 色 ， 杆 状 ， 长 短 不 一 ， 容 易 分 辨 （ 图 3） 。讨 论自 由 生 活 的 阿 米 巴 滋 养 体 如 同 微 生 物 界 的 “ 特 洛伊 木 马 ” ， 以 吞 噬 多 种 细 菌 等 微 生 物 为 食 8。 但 其 中有 多 种 细 菌 具 有 抗 自 由 生 活 阿 米 巴 滋 养 体 “ 功 能 ” ，并 与 其 处 于 一 定 程 度 的 寄 生 或 共 生 状 态 ， 称 为 抗 阿 米巴 细 菌 （ amoebae-resisting bac
21、teria） 9。 嗜 肺 军 团 菌 是首 先 被 发 现 能 在 阿 米 巴 滋 养 体 内 生 存 、 繁 殖 的 胞 内菌 1。 有 关 胞 内 菌 形 态 学 研 究 ， 一 直 采 用 电 镜 观 察 方法 。 电 镜 观 察 结 果 是 判 断 细 菌 能 否 在 阿 米 巴 滋 养 体 内生 长 、 增 殖 的 形 态 学 方 面 的 “ 金 标 准 ” 。 用 电 镜 能 观察 到 嗜 肺 军 团 菌 在 阿 米 巴 滋 养 体 内 的 生 长 过 程 ， 甚 至能 清 楚 的 观 察 到 不 同 形 态 的 二 分 裂 状 态 。 但 本 法 费 用较 高 ， 制 作 超
22、薄 切 片 步 骤 复 杂 ， 观 察 结 果 耗 时 较 长 。本 次 实 验 采 用 多 种 染 色 方 法 ， 对 阿 米 巴 滋 养 体 内嗜 肺 军 团 菌 进 行 观 察 。 结 果 显 示 ， Gimenez 染 色 敏 感 性较 高 ， 操 作 简 便 。 阿 米 巴 滋 养 体 （ 包 囊 ） 呈 蓝 绿 色 ，嗜 肺 军 团 菌 呈 鲜 红 色 。 复 染 方 法 的 改 进 使 红 、 蓝 两 色对 比 清 晰 ， 较 Giemsa 和 免 疫 荧 光 染 色 分 辨 明 显 ， 在共 培 养 初 期 阿 米 巴 滋 养 体 吞 噬 少 量 菌 体 时 也 能 观 察 到
23、142中 国 寄 生 虫 学 与 寄 生 虫 病 杂 志 2005 年 8 月 第 23 卷 第 4 期 Chin J Parasitol Parasit Dis Aug.2005， Vol.23， No.4明显的胞内菌体。本法灵敏度高，省时（全过程不超过 10 min）、耗材少，操作简便。适合于实验室检测和临床初步诊断鉴别。阿米巴滋养体呈蓝绿色，胞内嗜肺军团菌呈红色（ 1 000） A：嗜肺军团菌呈短杆状，数量较少； B：嗜肺军团菌数量增多，呈红色团状充满阿米巴空泡和（或）胞浆； C：嗜肺军团菌呈短杆、长杆混合分布于空泡和（或）胞浆； D：嗜肺军团菌呈红色长杆状分布于胞浆。Amoeba tr
24、ophozoites stained in blue with bacteria inside in red（ 1 000） A： In early co-culture， a few bacteria can be detected within amoebae； B： In anaphaseof co-culture， number of bacteria in red increased and filled in amoeba vacuole or plasma； C： In anaphase of co-culture， some bacteria shown in short or
25、 long rod with-in amoeba vacuole or plasma； D： In anaphase of co-culture， bacteria in the shape of long rod within amoebae.图 1 吉曼尼兹染色Fig.1 Gimenez staining阿米巴滋养体呈浅蓝色，核和空泡明显，嗜肺军团菌呈深蓝色（ 1 000）In anaphase of co-culture， showing amoebal bacteria in dark blue（ 1 000）图 2 姬姆萨染色Fig.2 Giemsa staining阿米巴滋养体呈现
26、出非特异性黄绿色，着色较暗，嗜肺军团菌呈特异性亮绿色（ 1 000）In anaphase of co-culture， amoebal bacteria in differential bright green（ 1 000）图 3 免疫荧光抗体染色Fig.3 Immunofluorescent staining参 考 文 献 1 Rowbotham TJ. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneu-mophila for freshwater and soil amoebae J . J Clin Pathol，
27、1980， 33： 1179-1183. 2 Adeleke MS， Janet P， Robert B， et al. Legionella-like and other amoebalpathogens-phylogenetic status and possible role in respiratory disease J . E-merg Infect Dis， 1996， 2： 225-230. 3 Gibert G， Didier R. Parachlamydiaceae： potential emerging pathogens J .Emerg Infect Dis， 200
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29、nviron Microbiol， 2003， 1：600-606. 6 Kirkwood ML. Soil amoebae help to unravel fungal pathogenesis J . TrendMicrobiol， 2002， 10： 116. 7 La Scola B， Audic S， Robert C， et al. A giant virus in the amoebae J .Science， 2003， 229： 2033. 8 Barker J， Brown MR. Trojan horses of the microbial world： protozoa
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