1、2011年2月第34卷第1期BMU Journal，Feb20 ， ： ： ： 29 介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法 张兴元 宋向芹 张芳 欧琨 吕 毅 1滨州医学院附属医院滨州市256603；2西安交通大学第一附属医院 【摘要】 目的介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法在Selgen两步胶原酶灌注法基础上加以改进，进行 大鼠原代肝细胞分离。结果 平均每只成年SD大鼠获取(156031)10 个肝细胞，平均肝细胞活率(95142)，平 均肝细胞纯度98。结论本试验介绍方法简便易行，且肝细胞产量高、活力好、纯度高，适宜在一般条件实验室推广应用。 【关键词】 关键词：原代肝细胞
2、；分离；胶原酶 【中图分类号】R3292【文献标识码】A【文章编号】1001-9510(2011)01-0029-04 Introduce a facility and high efficiency separation method of rat primary hepatocytes ZHANG Xingyuan SONG Xiangqin ZHANG Fang OU Kun LI3 Yi 1 Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603；2 the First Affiliated Hospital o
3、f X n Jiaotong University 【Abstract】0bjective Introduce a facility and high efficiency separation method of rat primary hepatocytesMethods Rat hepato- cytes were isolated and purified by using the modified SelgenS tWOstep methodResults The average yield of rat hepatocytes was (156031)10 percent rat，
4、with an average viability of(95142)and purity of98Conclusions The separation meth od of hepatocytes was simple and easy-with advantages of high yield，good viability and high purity，SO it would be applied widely in or dinary laboratory 【Key words】Primary hepatocytes；Separate；Collagenase 大鼠原代肝细胞体外培养是一
5、种可以模拟体内 肝细胞进行肝细胞生长分化、结构功能及药物干预 等研究的简单有效方法2 J。肝细胞原代培养实验 中，肝细胞的分离是关键步骤，目前应用最广、效果 最好的肝细胞分离方法是Selgen两步胶原酶灌注 法 J，但是该方法缺点是需要大量胶原酶、成本高， 且需要一定的特殊设备 J，因而限制了在普通条 件实验室的应用。本试验在Selgen两步胶原酶灌 注法的基础上加以改进，以一种简便易行的方法进 行肝细胞分离，可以获得数量多、活性高的大鼠原代 肝细胞，现报道如下。 1材料与方法 11实验动物 选择3月龄、清洁级、雄性SD大 鼠15只，体质量200250 g，由西安交通大学医学 院实验动物中心提
6、供。术前12 h禁食，4 h禁饮。 基金资助项目：滨州医学院科技计划(BY2007KJ33) 12主要试剂DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购 自GIBCO公司，型胶原酶、二甲基亚砜(DMSO)、 HEPES购自Sigma公司，Percoll密度分离液购自瑞 典Pharmacia公司，兔抗鼠CK-18单抗、DAB显色试 剂盒购自武汉博士德公司，其它试剂为分析纯。 13主要缓冲液配制方法所有缓冲液均经022 p,m双层滤膜过滤除菌，4 cI=分装保存。前灌注液 (gL)：NaC1 818，KC1 040，Na2HPO4 011， KH2PO4 006，NaHCO3 035，EDTA 020，HE
7、PES 596，pH值7476。胶原酶灌注液(gL)：NaC1 8O0，KC1 040，CaC12 056，Na2HPO4 019，NaHCO3 035，HEPES 238，IV型胶原酶050，pH值72 74。肝细胞清洗液(1 000 m1)：DMEM培养基1 袋，035g，HEPES 238 g，庆大霉素200 kU，pH值 7274。Percoll密度分离液：先用9份Percoll与 3O 1份10PBS混合，达到生理性渗透压，然后用PBS 稀释至比重1080 gml。 14方法 141大鼠原代肝细胞的分离：参照Selgen两步胶 原酶灌注法 加以改进分离大鼠原代肝细胞。SD 大鼠腹腔注
8、射氯胺酮(10 mgKg)麻醉成功，置于 75乙醇中静置10 S(头颈部除外)，移至手术台， 铺无菌中单，固定，带洞无菌单覆盖大鼠；腹部大十 字切口开腹，更换手术器械，将肠管推至左下腹，距 肝门1 cm解剖门静脉约15 cm，结扎脾静脉，门静 脉预置两根细线，游离下腔静脉并预置牵引线；在门 静脉两细线之间剪开门静脉前壁，迅速插入12号静 脉留置针，将近肝门处细线打结固定，以37预热 的前灌注液重力滴注，速度约为25 mlmin，快速剪 开下腔静脉，见有大量血液流出，后颜色逐渐变淡； 约10 min后，肝脏呈均匀的土黄色，下腔静脉流出 液颜色与灌注液相同；无菌分离肝脏(勿损伤肝包 膜)，将其置于
9、12 cm无菌培养皿内，改用005含 图1 胶原酶溶液离体循环灌注肝脏 142肝细胞产量及细胞活率：将100 l细胞悬 液与100 Ixl 04台盼蓝溶液混合，血细胞计数板 计算计算细胞产量及细胞活率，每次重复计数3次。 细胞产量=4个大方格细胞数410 稀释 倍数细胞悬液体积(m1) 细胞活率=(细胞总数一死亡细胞数)tltt胞总 数100 143肝细胞鉴定 1431细胞滴片HE染色：调整肝细胞密度至2 10 ml，取200 ILl细胞悬液滴于载玻片上，冷丙酮 固定15 min，苏木素、伊红溶液染色，脱水、透明、封 2011年2月第34卷第1期BMU Journal，Feb2011Vo134
10、N01 钙的胶原酶灌注液30 ml，37 cC循环灌注(图1)， 流速5 mlmin，约10 min后，肝脏呈龟裂状；将肝脏 移至另一无菌培养皿中，内置60 ml预冷的不含血 清的肝细胞清洗液，小心撕破肝包膜，轻轻抖落肝细 胞，制成肝细胞悬液。将肝细胞悬液先经过100目 的不锈钢滤网，以除去结缔组织和细胞团块，300 r min离心，5 min；然后细胞悬液再经过200目的不锈 钢滤网过滤，300 rmin离心3 min，重复两次。向沉 淀的肝细胞中加入5O ml肝细胞清洗液，轻轻吹打 均匀，加入到预先配制好Percoll密度分离液中，500 rmin离心5 min，肝细胞由于密度接近Perc
11、oll密度 分离液而悬浮于其中，组织碎片沉于底部，而肝非实 质细胞、破碎肝细胞及红细胞等漂于顶部；弃上清， 取肝细胞并向其中加入适量含10FBS的肝细胞 培养液中，轻轻吹打均匀，制成肝细胞悬液。镜下见 肝细胞透亮，圆形或椭圆形，核居中，透光度好(图 2)。 图2分离的大鼠原代肝细胞显微镜下形态(200) 片，显微镜下观察，拍照。 1432透射电镜观察细胞超微结构：取5 ml肝 细胞悬液，2 000 rrain速度离心10 min，弃上清，底 部肝细胞沉淀中加入25的戊二醛固定液4固 定过夜，1四氧化锇固定2 h，乙醇梯度脱水，常规 包埋、切片、染色，日立H-600透射电镜下观察肝细 胞特征性标
12、志。 1433 SABC免疫组化染色：取细胞滴片冷丙酮 固定15 rain，抗原修复、封闭，滴加抗CK-18抗体，37 60 rain，滴加SABC，37 oC15 min，DAB染色，苏木 素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察、拍照。 医学院学报 生 旦箜 鲞箜 塑旦 ： ： ： ： ： !： 2 结果 21 肝细胞产量及细胞活率本试验在Seglen两 步胶原酶灌注法基础上加以修改，进行SD大鼠原 代肝细胞分离。共进行了l5只SD大鼠实验，成功 12只另3只因操作意外死亡(1例麻醉过量、2例 门静脉插管失败)，实验成功率为80。12只SD 大鼠成功完成了原代肝细胞分离实验，平均每只成 年S
13、D大鼠获取(156031)x 10 个肝细胞，平均 图3大鼠原代肝细胞形态(HE200) 图5肝细胞浆内CK一18蛋白阳性表达(x400) 3讨论 肝细胞的分离是肝细胞体外实验的重要基础和 关键步骤，如何获得高活力、数量多的肝细胞，分离 技术是关键的第一步 。最初分离肝细胞主要采 用机械分离法 J，由于该法对肝细胞损伤严重且细 胞活力不高而被淘汰。1976年Seglen创立的两步 胶原酶灌注法对细胞膜损伤小且分离彻底，是目前 最常用的肝细胞分离方法 J，但此法的缺点是所需 胶原酶量大、成本高，一次性灌注消化一只成年大鼠 肝脏需要75100 mg胶原酶，浪费严重，且需要蠕 动泵等设备，所以限制了
14、进一步广泛应用 。我们 31 肝细胞活率(95142)，平均肝细胞纯度98。 22肝细胞鉴定 细胞滴片HE染色可见肝细胞 形态呈圆形、椭圆形或多边形，胞浆红染，胞核呈蓝 色，可见双核(图3)；透射电镜下见细胞内有大量的 车轮状线粒体、内质网、玫瑰花形糖原颗粒等肝细胞 特征性超微结构(图4)；免疫组化结果显示肝细胞 胞浆内有大量棕黄色物质，提示CK一18蛋白阳性表 达(图5)。 图4肝细胞车轮状线粒体(TEM，15 000) 在Seglen两步胶原酶灌注法基础上加以修改，首先 将第二步由胶原酶溶液一次性在体灌注改为离体循 环灌注，并保持灌注液温度37，此法可以重复利 用胶原酶溶液，从而节省昂贵的
15、胶原酶，节约成本； 其次，在分离纯化肝细胞时，采用低速离心(300 r rain)加Percoll密度梯度离心纯化肝细胞。Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，渗透压低， 粘度也很小，而且Percoll不穿透生物膜，对细胞无 毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分，还可将 受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离 。我们 根据大鼠肝细胞的比重10701090 gml，配制比 重为1080 gml的Percoll密度分离液，经过500 r min5 min的离心后，肝细胞悬浮于Percoll密度分 离液中，组织碎片沉于底部，肝间质细胞、细胞碎片 及残留的红细胞漂浮于密度分离液之上，提高了肝
16、 细胞的活率和纯度。结果显示每个成年SD大鼠肝 脏只需1520 mg胶原酶就可以完成肝细胞的分 离，细胞产量达15610 ，细胞活率达951，纯 度达98，优于传统的Seglen两步胶原酶灌注法。 本试验分离得到的大鼠原代肝细胞HE染色见 细胞形态良好，结构清晰，胞内可见双核；透射电镜 32 下见细胞内有肝细胞特征性结构：大量的车轮状线 粒体、内质网、玫瑰花形糖原颗粒等；免疫组化结果 显示胞浆内有大鼠肝细胞特征性角蛋白CK18蛋 白呈阳性表达，这同文献报道 一致。 本试验在Selgen两步胶原酶灌注法基础上加 以改进，采用胶原酶离体循环灌注，减少了胶原酶用 量，降低了成本；采用低速离心加Per
17、coll密度梯度 离心纯化肝细胞，提高了肝细胞的活率和纯度，成功 进行了大鼠原代肝细胞分离实验。此方法分离肝细 胞简便易行，不需要特殊设备，且分离得到的肝细胞 产量高、活力好、纯度高，适宜在一般条件实验室推 广应用。 参考文献 1Michalopoulous GK，Bowen WC，Mule K，et a1Histological organi- zation in hepatocyte organoid culturesJAM J Pathol，2003，159 (17)：1877-1887 2Guo XG，MiaoJ Y，Wang ZYProtective effect of L-NAME
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