1、 1 全全全 全 RNARNA 純化試劑組純化試劑組純化試劑組純化試劑組 (Total RNA Miniprep Purification Kit) Cat # : TR01, TR01-150 Size : 50, 150 Reactions 產品敘述產品敘述產品敘述產品敘述 : Total RNA Miniprep Purification Kit 的步驟非常的簡單及快速， 分離各種動植物組織 、培養細胞和細菌 。 利用自旋管柱 (spin column)的型式純化 ，步驟 中使用 guanidium thiocyanate 使組織或細胞 裂解及均質化 。在加入酒精後 RNA會選擇性地與二
2、氧化矽膜結合 ，剩餘的基因體 DNA會被DNase I分解 ， 經過一連串快速地 ”清洗及離心 ”可去除 其他雜質 ，剩餘的 RNA與二氧化矽膜結合 ，最後 ，以無核酸酶的水洗脫 (elute)出二氧化矽膜 上的 RNA。注意若 RNA小於 200nt，例如 ：5S RNA, tRNA 和microRNA，無法在此系統中被有效地回收 。 此此此 此 kit 的內容物的內容物的內容物的內容物 : TR01 TR01-150 * 1. RNA Lysis Solution 35 ml (使用前加入使用前加入使用前加入使用前加入 2-ME 350ul) 105 ml (使用前加入使用前加入使用前加入
3、使用前加入 2-ME 1.05ml) * 2. DNase I Solution 2u/ul 120 ul 360 ul 3. DNase Incubation Buffer 4.5ml 13.5 ml 4. RNA Wash Solution I 55 ml 165 ml 5. RNA Wash solution II 16 ml (使用前加入使用前加入使用前加入使用前加入 酒精酒精酒精酒精 64ml) 48 ml (使用前加入使用前加入使用前加入使用前加入 酒精酒精酒精酒精 192 ml) 6. Nuclease-free water 10 ml 30 ml 7. RNA Spin col
4、umn with Collection tube 50 sets 150 sets 8. Collection tube 50 pcs 50 pcs DNase I 溶液儲存在 -20C，其他物品儲存在室溫 使用者需自備的材料使用者需自備的材料使用者需自備的材料使用者需自備的材料 ： ： circle6 2-Mercaptoethanol (2-ME)：為準備 RNA lysis solution 用 circle6 Rotor-stator 均質機 ( 例如 PolyTron )；或者 研缽、杵、 G20 針頭的針筒 circle6 70酒精 (用於動物組織和細胞 ) circle6 100
5、酒精 (1.為準備 RNA Wash Solution II 用； 2.純化動物纖維組織 ，例如：心臟 、肌肉和皮膚 ； 3.RNA 清洗用 ) circle6 Proteinase K(只用在動物纖維組織 ，例如 ，心臟 、肌肉和皮膚 ) circle6 PBS buffer(選擇性地用在貼附性培養細胞 ) circle6 Lysozyme(用於 細菌菌種 ) 2 前置步驟前置步驟前置步驟前置步驟 ： ： circle6 加入 350 l ( TR01) 或 1.05 ml ( TR01-150 ) 2-Mercaptoethanol 到 RNA Lysis Solution，儲存 RNA
6、Lysis/2-ME Solution 在 4C. circle6 加入 64 ml ( TR01 ) 或 192 ml ( TR01-150 ) 絶對酒精到 RNA Wash Solution II. 樣樣樣 樣 品品品 品 準準準 準 備備備 備 A. 組織培養細胞組織培養細胞組織培養細胞組織培養細胞 表表表 表 1:準備 細胞 的 RNA Lysis/2-ME Solution 體積 不要使用太多樣品 ，可能會阻塞 column，導致產量和品質降低 a. 懸浮生長的細胞懸浮生長的細胞懸浮生長的細胞懸浮生長的細胞 ( 10,000 rpm）1 分鐘 ，丟棄過濾液 。 如果 lysate/e
7、thanol mixture 多於 700ul，則再次加入剩餘的 lysate/ethanol mixture，重覆上面步驟離心 。 2. 將 RNA Spin Column 放回 原來的 Collect Tube，加入 500ul RNA Wash Solution I到 column，最高速離心 （ 10,000 rpm）1 分鐘 ，丟棄過濾液 。 3. 對於每一 RNA 分離 Column，事先 於另一管中 準備 80 l DNase Incubation Buffer 加入 2 l DNase I（輕拍或倒轉管子 混合 ，不要振盪處理 ！）， 以吸管尖吸取溶液到 RNA Spin Co
8、lumn 中心 ，室溫培養 15 分鐘 。 如果處理多個樣品 ，不要 使用 儲存 的 DNase I 溶液 ，要在加入 Spin Column前再配製 DNase I。 。 4. 加入 500 l RNA Wash Solution I 到 Column， ，最高速離心 （ 10,000 rpm） 1 分鐘 ，丟棄過濾液和 Collect Tube。 5. 組合 Spin Column 和新的 Collect Tube， ，加 600l RNA Wash Solution II 到Column， ，最高速離心 （ 10,000 rpm）1 分鐘，丟棄過濾液 。 6. 加入另外 600l RNA
9、 Wash Solution II 到 Column， ，最高速離心 （ 10,000 rpm）1 分鐘 ，丟棄過濾液 。 7. 將 Spin Column 裝回 Collect Tube，最高速離心 （ 10,000 rpm）3 分鐘 ，以移去殘留酒精 。 6 如果離心速度低於 10,000 rpm 或殘留酒精必需完全移除 ，將 Spin Column 置於 45-60烤箱 5 分鐘 ，蒸發所有酒精 。 8. 加 30-50 l nuclease-free water 到 Column 的過濾膜中心 ，最高速離心 （ 10,000 rpm）1 分鐘 ，儲存 RNA 樣品在 -70。 附錄附錄
10、附錄附錄 1： ：心臟 心臟心臟心臟 、 、肌肉和皮膚組織的 肌肉和皮膚組織的肌肉和皮膚組織的肌肉和皮膚組織的 RNA 分離分離分離分離 步驟步驟步驟步驟 多餘試劑和配備的需求多餘試劑和配備的需求多餘試劑和配備的需求多餘試劑和配備的需求 ： ： Proteianase K ( 20 mg/ml) 56C 水浴糟或加熱器 步驟步驟步驟步驟 ： ： 1. 加 300l of RNA Lysis Solution 到樣品 ( 10,000 rpm）3 分鐘 ，小心轉移上清液 （不要有 pellet）到另一新管子中 。 4. 加入 0.5 倍體積 （約 450 l） 100%酒精到細胞溶解液 ，以微量
11、吸管尖混合均勻 ，跳到 RNA 分離 部分 （頁 5） 加入酒精後不要離心 附錄附錄附錄附錄 II： ：RNARNA 清潔或基因體清潔或基因體清潔或基因體清潔或基因體 DNA 移除步驟移除步驟移除步驟移除步驟 此套組能用於 RNA 清潔 ，或移除基因體 DNA 的污染 1. 以 nuclease-free water 調整 RNA 體積到 100ul，加 350 l RNA Lysis/2-ME Solution，混合均勻 。 2. 加 250 l 的 100% 酒精到細胞溶解液 ，以微量吸管尖混合均勻 ，跳到 RNA 分離部分 （頁 5） 加入酒精後不要離心 台中技術部諮詢專線 :04-24833897 E-mail: 禾鑫生技開發企業社禾鑫生技開發企業社禾鑫生技開發企業社禾鑫生技開發企業社
