1、DATA SHEET 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China Tel: 86-22-60524017 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 35441562 E-mail: 灏洋生物 TBDsciences 1ProductInformation Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 ProductNumber: Annexin
2、2009FITC Size:20T 产品编号 产品名称 包装 试剂 A Annexin V-FITC 100l 试剂 B Annexin V-FITC 结合液(4X) 3ml 试剂 C 碘化丙啶染色液 220l 说明书 1 份 产品简介： Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用 FITC 标 记的重组人 Annexin V 来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。 可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。 Annexin 是一类广泛分布于真核细胞细胞
3、浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。 但仅 Annexin V 被报道可以调控一些 PKC 的活性。 Annexin V 选择性结合磷酯酰丝氨酸 (phosphatidylserine，简称 PS)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细 胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外 翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而 Annexin V 和 外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。 用带有绿色荧光的荧光探针 FITC 标记的 Annexin V，即 Annexi
4、n V-FITC，就可以用流式细胞仪或 荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。 本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液， 碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞， 呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失， Annexin V-FITC 可以进入到细胞浆内， 与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。 综上所述，参考下图，用 Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被 Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色；凋亡早期的细胞仅被 Annexin V-FITC 染色，碘化丙啶染色呈阴性；
5、坏死细胞和凋亡晚 期的细胞可以同时被 Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色。下图左上角出现的是许可范围内的检测误差。 DATA SHEET 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China Tel: 86-22-60524017 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 35441562 E-mail: 灏洋生物 TBDsciences 2保存条
6、件： 4保存， Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。为长期保存，可以把 Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色液适当分装后 -20保存， Annexin V-FITC 结合液可以直接 -20保存。 注意事项： 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注 意避光保存。 需自备 PBS。另外，使用前 Annexin V-FITC 结合液 (4X)必须稀释成 1X。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套
7、操作 使用说明： 准备工作：取适量 Annexin V-FITC 结合液 (4X)，用 MilliQ 级纯水或双蒸水稀释至 1X。例如 1ml Annexin V-FITC 结合液 (4X)中加入 3ml MilliQ 级纯水或双蒸水，混匀后即为 Annexin V-FITC 结合液 (1X)。 Annexin V-FITC 结合液 (1X)如果有多余可以 -20保存，以备下次使用。 1.对于悬浮细胞： A.在进行完细胞凋亡刺激后， 1000g (约 1000-2000rpm)离心 5 分钟，弃上清，收集细胞，用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。注意： PBS 重悬不能省略， PBS 重悬的过程同
8、时也起到了洗涤细胞的作用， 可以保证 后续 Annexin V-FITC 的结合。 B.取 5-10 万重悬的细胞， 1000g 离心 5 分钟， 弃上清， 加入 195 l Annexin V-FITC 结合液 (1X) 轻轻重悬细胞。 C.加入 5 l Annexin V-FITC，轻轻混匀。 D.室温 (20-25 )避光孵育 10 分钟。可以使用铝箔进行避光。 E.1000g 离心 5 分钟，弃上清，加入 190 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)轻轻重悬细胞。 F.加入 10 l 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 G.随即进行流式细胞仪检测， Annexin
9、V-FITC 为绿色荧光， PI 为红色荧光。如果用于荧光显微镜 下检测， 1000g 离心 5 分钟，收集细胞，用 50-100 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)轻轻重悬细胞，涂 片后，荧光显微镜下观察。 DATA SHEET 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China Tel: 86-22-60524017 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ
10、:387745440 35441562 E-mail: 灏洋生物 TBDsciences 32.对于贴壁细胞： A.把细胞培养液吸出至一合适离心管内， PBS 洗涤贴壁细胞一次， 用胰酶细胞消化液 (可含有 EDTA) 消化细胞。 B.细胞消化下来后，加入步骤 2A 中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内， 1000g 离心 5 分钟，弃上清，收集细胞，用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。 C.取 5-10 万重悬的细胞， 1000g 离心 5 分钟， 弃上清， 加入 195 l Annexin V-FITC 结合液 (1X) 轻轻重悬细胞。 D.加入 5 l Annexin V-FITC，
11、轻轻混匀。 E.室温 (20-25 )避光孵育 10 分钟。可以使用铝箔进行避光。 F.1000g 离心 5 分钟，弃上清，加入 190 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)轻轻重悬细胞。 G.加入 10 l 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 H.随即进行流式细胞仪检测， Annexin V-FITC 为绿色荧光， PI 为红色荧光。如果用于荧光显微镜 下检测， 1000g 离心 5 分钟，收集细胞，用 50-100 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)轻轻重悬细胞，涂 片后，荧光显微镜下观察。 3.对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测： 注： 本方法的优点是可
12、以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。 A.(选做 )如果条件许可，把细胞培养于 24 孔板、 48 孔板或 96 孔板内。在凋亡诱导结束后，用可 以对多孔板进行离心的离心机 1000g 离心 5 分钟。 B.吸除细胞培养液，加入 PBS 洗涤一次。 (如果条件许可，在吸除 PBS 前 1000g 离心 5 分钟。 ) C.加入 195 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)。 D.加入 5 l Annexin V-FITC，轻轻混匀。 E.室温 (20-25 )避光孵育 10 分钟。可以使用铝箔进行避光。 F.吸除溶液，加入 190 l Annexin V-FITC 结合液 (1X)轻轻重悬细胞。 (如果条件许可，在吸除溶 液前 1000g 离心 5 分钟。 G.加入 10 l 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 H.随即在荧光显微镜下观察， Annexin V-FITC 为绿色荧光， PI 为红色荧光。
