1、基因信息的传递,第三篇,DNA,遗传信息传递的中心法则,基因（gene）：DNA上的功能单位，能够编码RNA或者蛋白质的一段DNA序列。 DNA储存者；RNA传递者；Protein体现者,DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication)复制的高保真性(high fidelity) 双向
2、复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),一、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G
3、 G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,实验结果支持半保留复制的设想,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意
4、义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、复制的半不连续性,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的
5、，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,*复制是酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种物质 的共同参与： 1、底物： dNTPs模板：亲代DNA双链 2、RNA引物：提供 3-OH末端 3、酶和蛋白质因子：拓朴异构酶、解旋酶、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、单链结合蛋白等,参与复制的物质,一、复制的化
6、学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二、DNA聚合酶,DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol） 又称为DNA依赖的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase，DDDP）,原核生物的DNA聚合酶：I、II、III；3种 真核生物的DNA聚合酶：、5种,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DN
7、A-pol ,（一）原核生物的DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol ,二级结构主要由18个螺旋肽段。肽段之间由非螺旋结构连接。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol ,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA-pol ,由10种亚基组成不对称异源二聚体,DNA聚合酶III：新链延长
8、，复制种起聚合作用的主要酶。,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶的共同的特点,以dNTP为底物 合成DNA链具有模板依赖性，严格遵循碱基互补配对原则 聚合方向为53，催化核苷酸以3，5-磷酸二酯键相互连接 均需在引物的3-OH末端延伸DNA链，而不能从头合成DNA链。,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基
9、配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,（二）复制的保真性和碱基选择, DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3
10、. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E. Coli 基因图,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,（二）DNA拓扑异构酶(DNA
11、 topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,将有切口的DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端连接，使二者生成3 ，5磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。,功能：连接DNA最后缺口的作用 DNA修复、重组、剪接中起缝合缺口的作用基因
12、工程种常用的工具酶,五、DNA连接酶（DNA ligase）,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,oriC跨度145 bp，碱基序列分析发现这段DNA上游有3组串连重复序列和2对反向重复序列，上游串连重复序列为识别区；下游反向重复序列富含AT区，易于解链。,1. DNA解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引
13、发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止, RNA酶水解RNA引物， 引物留下的缺口由DNA聚合酶I催化，dNTP逐一自5 3端聚合而填补。 两不连续片
14、段相邻的 5-P 和3-OH 还有一个切口，则由DNA连接酶加以连接。,复制中随从链中的不连续的冈崎片段需连接成连续的子链,*复制过程的顺序性,双链的解开（解超螺旋、解双链） RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（随从链）,DNA拓扑异构酶,解链酶,单链DNA结合蛋白,引物酶,引物RNA,DNA聚合酶III,DNA聚合酶I,DNA连接酶,RNA酶,端粒（telomere）：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，富含GxTy的正向重复序列。端粒DNA受特殊蛋白质保护，不被核酸酶水解。,真核生物染色体DNA采取线性复制方式。子链5-端的一段RNA引物被
15、水解后，留下的空隙由端粒的端粒酶爬行式复制而不缩短。,端粒酶(telomerase),组成,端粒酶（telomerase）：保护端粒的特殊蛋白质，是一种核糖核蛋白，是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质构成，能识别和结合端粒序列。其中RNA大约有150个核苷酸，富含CxAy，正好与端粒序列GxTy的单链呈杂交结合状态。,端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),
16、端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,老化与端粒酶活性下降有关：培养的人成纤维细胞随着培养传代次数增加，端粒长度是逐渐缩短的。生殖细胞端粒长于体细胞，成年人细胞比胚胎细胞端粒短。实验证明：至少在细胞水平，老化是和端粒酶活力下降有关的。 肿瘤发生与端粒酶活性增高有关：某些肿瘤细胞的端粒比正常同类细胞显著缩短。增殖活跃的肿瘤培养细胞的端粒酶活性增高。,端粒酶成为研究的热点,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,一、逆转录病毒和逆转录酶,以RNA为模板，依照RNA中核苷酸序列
17、，以dNTPs为原料合成DNA。因与通常转录中DNARNA相反，故称为逆转录（反转录reverse transcription）。逆转录由逆转录酶（反转录酶，reverse transcriptase）催化。,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代
18、与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,化学因素,三、突变的分子改变类型,错
19、配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,移框突变：指缺失或插入（核苷酸）的突变，引起三联密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出一级结构完全不同的另一种蛋白质。,缺失引起框移突变,血友病（haemop
20、hilia）最常见的遗传性凝血功能障碍所致出血性疾病，属X性连锁隐性遗传，受累男性呈出血表型而女性仅为携带者。甲型血友病（或血友病A）是凝血因子IIIV（F IIIV）缺乏所致，发病的分子机制是F IIIV基因突变，主要为点突变或少数硷基的缺失和插入以及第22内含子的大片段倒位。乙型血友病（或血友病B）则起因于凝血因子IX的缺乏，其分子机制是分布于整个基因各处的多种形式的突变。,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复,修复(repairi
21、ng) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复,修复的主要类型,（一）光修复,光修复酶(photolyase),UV,（二）切除修复,E.coli的切除修复机制,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。 着色性干皮病/人类/DNA损伤后的修复缺陷,（三）重组修复,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一
22、个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,DNA replication begins at specific origins, is semiconservative, bidirectional, and semidiscontinuous.All DNA polymerases need a primer, extend the DNA chain in 5 to 3 direction (using dNTPs), and have 3
23、to 5 exonuclease activity for proofreading.DNA polymerase III in E. coli, DNA polymerase in eukayrotic cells are responsible for DNA relication in vivo.DNA replisomes contain many protein components including helicases, single-stranded DNA binding proteins, topoisomerases, primases, ligases etc.,Summary,Review,基因信息传递的现代中心法则DNA半保留复制的概念DNA半不连续性合成过程 DDDP的特点DNA复制参与的酶和蛋白因子（原核生物）DNA合成的生物学意义逆转录的概念 DNA损伤修复的四种类型、框移突变,附 录,E. Coli中的DNA聚合酶,
