1、流脑实验室诊断技术,黑龙江省疾病控制中心免疫规划所,内容提要,流脑疾病简介 流脑流行情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,疾病简介,流行性脑脊髓膜炎（Cerebo-spinal meningitidis，CSM）简称流脑，是由脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria Meningitidis，Nm）感染脑膜或脑脊髓膜引起的急性呼吸道传染病，常在冬春季节发病和流行。该病起病急、病情重，有发热、头痛、呕吐、皮肤出血点及脑膜炎刺激征。,内容提要,流脑疾病简介 流脑流行情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,流脑流行情况（国际）,流脑从病原学的发
2、现至今已有100多年的历史，现在仍是一种常见的呼吸道传染病，病死率高。 流脑遍布全球，在温带地区可出现地方性流行，经常有散在病例出现，在冬春季节会出现季节性发病高峰。 全世界每年发生流脑病例超过50万，平均年发病率为1/10万10/10万，但在流行地区，流行期可达100/10万500/10万。但至今仍然未得到有效的控制，全球每年仍有30多个国家和地区受到严重威胁。,流脑流行情况（中国）,我国是流脑高发国家之一，一般非流行年全国发病率为3/10万10/10万，小流行年为30/10万50/10万，大流行年可高达100/10万500/10万。 全国发病率 疫苗使用前，发病率水平较高，多在20/10万
3、左右 1967年曾达到403/10万，发病超过304万，死亡数超过16万 A群流脑疫苗广泛使用后，发病率大幅度下降，病死率仍然维持在较高水平。 1990年起1/10万； 2000年起0.2/10万，病例数少于3000例。 流脑流行周期 疫苗使用前，每8-10年出现一次流行。 广泛使用疫苗后，流行周期不明显。,流脑流行情况（中国）,1950-2007年全国流脑报告发病率、死亡率及病死率,流脑流行情况（中国）,1970年,1990年,2000年,2007年,不同年份流脑高发省份变迁,流脑流行情况（中国）,流行季节高峰依然存在 2-4月份 流脑发病年龄后移，职业以中小学生为主 疫苗使用前 6月-2岁
4、婴儿发病率较高 疫苗使用后 1岁儿童发病率增多,部分地区，民工等职业人群发病率较高； 15岁病例占65%-75% 流脑聚集性病例或暴发不断出现,内容提要,流脑疾病简介 流脑流行情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,流脑病原学,一、形态及染色 脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）为脑膜炎革兰氏阴性球菌，成双排列，两球面接触平坦或略向内凹，呈肾形或咖啡豆状。菌体直径约0.60.8m、无鞭毛、无芽胞，此菌可产生自溶酶涂片检查可常见破碎的菌体。在光学显微镜下，脑膜炎球菌和淋球菌不容易分辩。,流脑病原学,在光学显微镜下观察：,（革兰染色，放大1000倍）,流脑病原学,二、培养特性脑膜炎
5、球菌可自带菌者的鼻咽部或病人的脑脊液、血液、皮肤出血点挤出液中检出，对营养要求较高，因对蛋白胨和琼脂中所含脂肪酸和微量金属非常敏感，故在普通培养基上不易生长。,流脑病原学,脑膜炎球菌为专性需氧菌。最适PH为7.27.4，最适培养温度为3637，低于25或高于40不生长。 常用培养基为血琼脂，巧克力琼脂或卵黄平板。在37培养24h后，在巧克力或血培养基或卵黄培养基上生长良好。 Nm为需氧菌，菌落直径为0.5mm2mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色，透明或半透明、似露珠状、不溶血、不产色素。培养时间延长，菌落增大，着色深浅不一致，不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。,流脑病原学,脑膜
6、炎奈瑟菌培养在巧克力琼脂上，显示灰白色菌落，其氧化酶阳性。（巧克力琼脂，18小时，37）,流脑病原学,三、生化反应 Nm能分解葡萄糖、麦芽糖；产酸不产气，不发酵蔗糖、果糖、乳糖，不液化明胶，V.P、靛基质、硫化氢试验均为阴性，氧化酶阳性。,流脑病原学,四、抵抗力 Nm的抵抗力较弱，对干燥、热均很敏感。在生理盐水中仅能存活数小时，加热60，5min即可死亡。对各种化学剂亦敏感，在1%酚、0.1%升汞，10%甲醛（福尔马林），浸泡数分钟即可被杀死。 抗生素选择：对青霉素、氨苄西林、美洛培南、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、米诺环素、阿奇霉素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明等12种抗生素开展耐
7、药性检测均较敏感。,流脑病原学,耐药的Nm菌株增多 对青霉素耐药的菌株少见 未发现对氯霉素耐药的菌株 对磺胺药物耐药的菌株较多,流脑病原学,2007年流脑病例菌株耐药性检测结果,对复方新诺明完全耐药,流脑病原学,黑龙江省流脑菌群耐药性监测 2006年、2008年对我省分离出的A群脑膜炎奈瑟氏菌进行耐药性检测。 结果显示： 敏感药物-头孢噻肟、头孢曲松、阿齐霉素、 米诺环素、氯霉素、利福平 耐药-环丙沙星、磺胺甲噁唑,流脑病原学,五、抗原结构与分析 Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）、主要外膜蛋白（Outer membr
8、ane protein，OMP）、铁调节蛋白、脂寡糖、还有菌毛抗原等。特异性荚膜多糖是分群的基础，而外膜蛋白和脂多糖是分型的物质，对人的致病性及免疫性起重要作用。 根据荚膜多糖抗原的不同，可将Nm分为13群：A、B、C、D、X、Y、Z、29E、W135、H、I、K、L13个血清群。 我国流行菌株以A群为主，C群在某些省份已成为发病的优势菌群。,内容提要,流脑疾病简介 流脑流行情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,流脑流行病学,传染源 病人 Nm的宿主是人，病人和带菌者是传染源，只在人间传播。病原菌存在于病人或带菌者的鼻咽部。敏感抗生素治疗24h后，不具有传染性。
9、 病后带菌者 约有10%20%，其排菌时间可达数周至2年。带菌时间超过3个月以上者，称慢性带菌者，所带多为耐药菌株，常存在于带菌者鼻咽部深层淋巴组织内。带菌者或隐性感染者因不易发现，对周围人群的危险性大于病人。,流脑流行病学,带菌者 人群带菌率20%，提示可能发生流行；流行期间人群带菌率可达50%。 非流行期的带菌菌群常以B群为主，流行期间则A群所占百分比较高。,流脑流行病学,传播途径 带菌者和患者咳嗽、喷嚏等产生飞沫，直接经空气传播。 因病原菌在体外的生活力极弱，故通过日常用品间接传播的机会极少。密切接触对2岁以下婴儿的发病有重要意义。,流脑流行病学,易感者 人群普遍易感：未有效接种过流脑疫
10、苗，未患过流脑的人，都是Nm的易感者，约1%的被感染者可能发病。 新生儿出生时有来自母体的杀菌抗体，故很少发病， 23月龄以后婴儿即有发病者，6个月2岁婴儿发病率最高，以后又逐渐下降。在624个月时抗体水平下降至最低点，以后又逐渐增高，至20岁左右达到成人水平，人群的易感性与抗体水平密切相关。,流脑流行病学,由于相隔一定时间后人群免疫力下降，新的易感者逐渐积累增加，所以平均每隔10年左右有一次流行高峰。多年来国内外对带菌问题进行了广泛的调查。 一般带菌规律为流行期高，非流行期低；城市高，郊区低；成人高，儿童低；与病人密切接触者高；流行地区高，非流行地区低。一般带菌以B群为最高，占60%70%，
11、其次为C群，流行期内A群带菌率上升，爆发流行点A群的带菌率可达25%50%以上。,流脑流行病学,流行概况 流脑早在16世纪即被发现，其流行的地域分布极广，几乎遍及各大洲。各国之间流脑的发病水平差异很大，一般地讲，在发达国家中发病率较低，在发展中国家发病率相对较高而在非洲流脑流行带其发病率最高。 我国是流脑的高发国家，20世纪初各地均有流行的报告，近百年来我国曾有过5次全国性大流行即1938年、1949年、1959年、1967年和1977年。,流脑流行病学,流行特征 无论散发或流行，流脑的发病季节以冬春季为主。一般在1112月份流脑的发病开始上升，次年24月达高峰，此间的发病可占病例总数的60%
12、90%，5月下降，710月处于最低水平。主要是由于冬春季节接触密切，气候寒冷，干燥、呼吸道的抵抗力减弱，致使呼吸道疾病易于流行。,流脑流行病学,发病年龄以15岁以下儿童为主，5岁以下发病率最高，发病年龄与地域及免疫抗体的水平有关。一般大城市多为散发，以2岁以下发病率最高。中、小城市以29岁组为主，24岁最高。在偏僻山区，一旦有传染源介入，常导致暴发流行。 男女发病率大致相等。 近年来由于A群脑膜炎球菌多糖疫苗的广泛应用，大年龄组儿童的发病率得到了有效的控制，但由于多糖类疫苗为T细胞非依赖性抗原，对小于18月龄以下婴幼儿效果差，故小年龄组儿童没有得到有效的保护。,内容提要,流脑疾病简介 流脑流行
13、情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,诊断与鉴别诊断,一、发病机理 病原菌自鼻咽部侵入人体，如人体免疫力强，则可迅速将病原菌杀灭，或成为带菌状态；若体内缺乏特异性杀菌抗体，或细菌毒力较强时，则病菌可从鼻咽部黏膜进入血液，发展为败血症，继而累及脑脊髓膜，形成化脓性脑脊髓脑炎。,诊断与鉴别诊断,二、临床表现 （1）突然寒战、高热、恶心、呕吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、头痛加重。 （2）面色苍白、四肢发凉、皮肤发花并有散在的小出血点、唇周及指端青紫、唇周单纯疱疹。 （3）烦躁不安、谵妄、昏迷或惊厥。 （4）皮肤、黏膜瘀点典型或融合成瘀斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压
14、差缩小。 （5）颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。 （6）瞳孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。 （7）呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。 （8）幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外，还多见极度不安与惊厥、拒乳、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，其他脑膜刺激征可能缺项。前囟未闭者多见隆起，呕吐频繁而失水者也可出现囟门下陷。,诊断与鉴别诊断,三、诊断中华人民共和国国家标准GB16884-1997，规定了流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则。 诊断原则 （1）应根据流行病学资料和临床表现及实验室检验结果做出临床诊断。 （2）确诊需要培养Nm或检测Nm群特异多糖抗原或
15、Nm的DNA特异片段或检测病人急性期和恢复期血清中抗Nm特异抗体。,诊断与鉴别诊断,四、鉴别诊断 （1）其他化脓性脑膜炎：依侵入途径可初步区别。 （2）流行性乙型脑炎：其发病季节多在79月，脑实质损害严重，昏迷、惊厥多见，皮肤一般无瘀点。 （3）虚性脑膜炎：败血症、伤寒、大叶性肺炎等急性感染病人有严重毒血症时，可出现脑膜刺激征，但脑脊液除压力稍增高外，余均正常。 （4）中毒型细菌性痢疾：主要见于儿童，发病季节在夏秋季。短期内有高热、惊厥、昏迷、休克、呼吸衰竭等症状，但无瘀点，脑脊液检查正常。确诊依靠粪便细菌培养。 （5）蛛网膜下腔出血：成人多见，起病突然，以剧烈头痛为主，重者继以昏迷。,内容提
16、要,流脑疾病简介 流脑流行情况 流脑的病原学 流脑流行病学 流脑诊断与鉴别诊断 流脑实验室监测,流脑实验室监测,实验室监测 病原学监测 健康人带菌监测 人群免疫水平监测 耐药监测,流脑实验室监测,一、病原学监测标本采集、保存、运送及检测工作要 严格遵守病原微生物实验室生物安全管 理条例的规定。 标本的运送 各地市要将分离的阳性菌株送省级进行复核鉴定。 一部分保存于脱脂奶中-冷冻运送。 一部分保存在巧克力平板中-冷藏运送。巧克力平板保存：将分离的流脑阳性菌株接种于巧克力平板中，置5% C02，37培养24小时后保存于4度。,流脑实验室监测,医疗机构标本采集转运流程,流脑实验室监测,标本采集 脑脊
17、液(CSF)：如果怀疑为脑膜炎，CSF是用于分离和鉴定病原体最好的标本。取患者CSF2-3ml ，注入无菌的试管内。3000转/分，离心20分钟，用无菌吸管取沉淀物直接接种到10%羊血巧克力色琼脂平皿上做细菌培养。CSF沉渣还可涂片，作革兰氏染色镜检。CSF离心后的上清液可置-20，供做血清学检查脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异性抗原。,流脑实验室监测,血液：疾病早期，病人高热时采取静脉血57ml ，往盛有50ml 葡萄糖肉汤的三角瓶内注入35ml血做增菌培养。留2ml血注入无菌试管内分离血清，做血清学检查脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异抗原和急性期抗体。在病人病后13周采取第二次血液2ml ，注入无
18、菌试管内分离血清，检查病人恢复期抗体。若恢复期抗体的滴度比急性期升高4倍或4倍以上，具有追溯诊断的意义。,流脑实验室监测,淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤斑或淤血点，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌812小时后分离培养或直接接种EPV平板，再涂片染色直接镜检。涂片也可做免疫荧光检查。,流脑实验室监测,鼻咽拭子：对健康人群或病人密切接触者进行带菌检验时一般采咽拭子。咽拭子直接接种到10%巧克力色双抗血琼脂平皿或卵黄双抗琼脂平皿上分离Nm。咽拭子也可以插入卵黄双抗液体培养基或双抗兔血清肉汤中37，5%CO2增菌后再分离。,流脑实验室监测,尿液标本：取病人
19、急性期尿液5ml加20ml无水乙醇，置4 2小时，离心（3000转/分钟，15分钟），弃上清，收集沉淀部分加0.25ml磷酸盐缓冲液将其溶解，同前离心，吸取上清液检测脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异抗原。,流脑实验室监测,Nm的分离与鉴定 1、脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需510%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37 。 2、通过菌落肉眼形态学特征来判定是否对细菌进一步研究。 巧克力色血琼脂平板：5%CO2，37 培养24小时后，其菌落直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明、并可出现颗粒状中心和放射性周
20、边。,（巧克力色血琼脂平板）,流脑实验室监测,3、革兰氏染色：挑取可疑菌落作革兰氏染色。脑膜炎奈瑟氏菌（Nm） 应为脑膜炎革兰氏阴性球菌，成对排列，两球面接触平坦或略向内凹，呈卵圆形和肾形或咖啡豆状。菌体直径约0.60.8m大小、无鞭毛、无芽胞，此菌可产生自溶酶涂片检查可常见破碎的菌体。在光学显微镜下，脑膜炎球菌和淋球菌不容易分辩。,细菌染色的基本步骤为涂片干燥 固定染色。,涂片：取一张清洁无油脂的载玻片，加上一环生理盐水，用灭菌的接种环取菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。 干燥：一般在室温中使自然干燥。若须加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免标本烤焦，不堪检视。
21、 固定：一般用加热法，即将涂片迅速通过火焰23次，以玻片反面接触，热而不烫为度。 初染：将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1分钟后，用水冲洗。 媒染：滴加碘液，1分钟后水洗。 脱色：滴加95酒精，摇动玻片至紫色不再为酒精脱退为止（根据涂片之厚薄约需0.51分钟），用水冲洗。 复染：滴加复红，1分钟后水洗，待干，镜检。,在光学显微镜下观察：,（革兰染色，放大1000倍）,流脑实验室监测,4、生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。 （1）生化管：每一种糖接种之间要将灭菌环灭菌。置37 培养24小时观察结果。若不发酵时，应连续
22、观察7天。 （2）氧化酶试验：可用市售氧化酶试剂或新鲜配制的氧化酶试剂。用牙签挑取一部分待检菌落涂布到滤纸片上，再滴上试剂，阳性者立即出现红色，并且以后颜色逐渐加深。,Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，生化反应管颜色变为黄色 不分解蔗糖和乳糖，生化反应管颜色不变,流脑实验室监测,5、血清分型鉴定（玻片凝集试验）（1）目的是应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。 （2）材料待检的Nm菌株纯培养物。,流脑实验室监测,Nm诊断血清。多价I（包含A，B，C，D群），多价包含1889（Y），1890（H），1892（29E），多价包含319（W135），1916（X），1486（I），18
23、11（K）群及各群单价血清，共计14种。 洁净载玻片。 生理盐水。,流脑实验室监测,（3）试验方法 先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。 用白金耳刮取具有脑膜炎奈瑟氏菌典型形态及生化特性的待检菌苔少许，在玻片上蘸取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。 轻轻摇动玻片数次，在12min内出现明显凝集者，即为阳性。 检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价或多价血清。若发生凝集，再用单价血清定群。 在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。,检测时应注意：从病人分离的疑似Nm对现有诊断
24、血清皆不凝集者则应作进一步检查或送有条件研究单位进一步鉴定。,流脑实验室监测,菌种保存 （1）保温运送：脑膜炎双球菌对温度较为敏感，温度过低或过高均可导致菌株死亡。在运送样品及培养物（葡萄糖肉汤或平板培养基）时，应保持样品处于2036 之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。 （2）分离出脑膜炎双球菌的保存与运送：将鲜牛奶煮沸三次，每次煮沸后冷却，去除奶液上层的油脂（奶液上层的奶皮） ，8磅15分钟高压后分装成小管。将脑膜炎双球菌挑入含1ml脱脂牛奶中，将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。20 冷冻保存（半年到一年）并冷冻运送至省疾控中心。,流脑实验室监测,二、健康人带菌监测
25、（1）根据过去3年流脑平均发病水平、人口、地理分布特点，以及当地疾病预防控制机构工作能力等综合因素，每年在流脑高发县设立至少2个监测点，低发县设至少1个监测点，动态收集相关资料。（2）每个监测点分7个年龄组 ，每个年龄组采集至少30人的血清检测抗体水平。每年9月采血1次，每次采血2毫升，编号登记，进行流脑抗体水平的检测，同时注明采样对象接种流脑疫苗时间。,流脑实验室监测,（3）在开展人群抗体水平调查采集血液时，同时采集咽拭子标本，进行流脑菌株分离培养，了解健康人群Nm的带菌率、带菌群型。培养所获得的Nm菌株分纯鉴定合格后，将其纯培养物的菌苔刮到35支灭菌的脱脂牛奶菌种管中，置-20冰箱保存。（
26、4）抗体水平与带菌率检测完成后，尽快将结果上报，分离的菌株于检测完成后28d内送中国疾病预防控制中心传染病预防控制所进一步鉴定分析。,流脑实验室监测,三、耐药性监测 省级CDC收到病例菌株或密切接触者菌株后7d内应完成耐药性检测，耐药性检测方法推荐使用肉汤稀释法。可根据本省实际情况选择药物进行耐药性检测，推荐对青霉素、氨苄西林、美洛培南、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、米诺环素、阿奇霉素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明等12种药物开展耐药性检测。,流脑实验室监测,流脑病人A群和C群菌株对环丙沙星、左氧氟沙星和磺胺类药物具有较高的耐药率，而对青霉素、氨苄西林、美洛培南、头孢噻肟、氯霉素、米诺环素、利福平等7种抗生素均敏感。 C群病人来源菌株对磺胺类药物100% 耐药，C群健康携带者来源菌株对磺胺类药物的耐药率也很高。,谢谢大家！,
