1、 培菲康治疗前后肠易激综合征患者相关肠道益生菌群变化分析【摘要】 目的 观察培菲康治疗前后肠易激综合征(IBS)患者肠道相关益生菌群的变化。方法 选取符合罗马标准的 IBS 患者 60 例及年龄、性别相匹配的对照人群 20 人，IBS 患者包括腹泻型、便秘型、混合型、未分型 4 种类型，再将 IBS 患者随机分为 2 亚组，治疗组予以培菲康治疗，2 片，3 次/d，疗程为 4 周，对照组予以安慰剂治疗 4 周，比较治疗前后患者粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量的变化。结果 腹泻型 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均小于正常人群(P0.01)，混合型 IBS 患者粪便中双歧杆菌含量小于正常人群(P
2、0.01);服用培菲康 4 周后，患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均高于治疗前(P0.01); 以腹泻为主的 IBS 患者中，治疗有效者，治疗后粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量都要少于治疗无效者(P0.01)。结论 IBS 患者存在某种肠道菌群的量的变化，且外源性补充相关益生菌制剂时，患者病情的变化伴有粪便中益生菌群的变化。 【关键词】 肠易激综合征;益生菌;荧光定量 PCR;肠道菌群Abstract: Objective To analysis of the fecal Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. in patients with irri
3、table bowel syndrome (IBS) before and after treatment with bifid triple viable capsules for 4 weeks. Methods 60 participants with IBS, as defined by the Rome III criteria, were compared with age- and gender-matched control subjects (n=20). The IBS patients were divided into diarrhea group, constipat
4、ion group, alternating group and unclassified group. The patients in the diarrhea and constipation groups were further divided into treatment group (2 capsules, 3 times daily for 4 weeks) and the control group (placebo administration for 4 weeks). The variations in the number of the fecal Bifidobact
5、erium spp. and Lactobacillus spp. were analyzed before and after the intervention, using quantitative Real-time PCR.Results In the IBS patients with diarrhea, the amount of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. were smaller than that in healthy population (P0.01), and in the IBS patients of al
6、ternating type, the amount of Bifidobacterium spp. was smaller than that in healthy population (P0.01). 4 weeks after the treatment, the amounts of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. in all patients increased (P0.01). Diarrhea-predominant IBS patients who had improvements in the Symptom Sev
7、erity Score of IBS carried smaller amounts of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. than patients who had no improvement.Conclusion There are variations in the amounts of certain gut microbiota, and with exogenous replenishment of agents of probiotic microbiota, the conditions of the patients
8、vary with the variations of fecal probiotic microbiota.Key words：irritable bowel syndrome; probiotics; fluorescent Real-time PCR; gut microbiota肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床上最常见的一种胃肠道功能紊乱性疾病，发病率高，治疗困难1。目前尚无一种药物对所有 IBS 均有肯定疗效。有研究发现，肠道菌群的变化可能与 IBS 症状产生和持续存在有关，益生菌治疗 IBS 的疗效也在不断的观察中。本研究旨在观察补充一
9、定益生菌后，IBS 患者肠道相关菌群的变化情况。1 对象和方法1.1 对象选择 选择 2007 年 9 月2008 年 9 月于新华医院消化内科门诊就诊的 IBS 患者 60 例。诊断符合罗马标准2 ，经体格检查，血、尿、粪常规，血生化及 B 超，电子结肠镜等检查，排除器质性疾病。排除标准：怀孕期或哺乳期患者，有肠道器质性疾病或其他系统严重疾病者，有腹部手术史者或其他无法充分合作者;且患者近 2 个月未使用过抗生素及相关益生菌制剂。同时根据年龄、性别比例，选取正常对照人群 20 人。一般资料见表 1。1.2 方法 将所有 IBS 患者随机分为 2 组，治疗组予以培菲康治疗 4 周，2 片，3
10、次/d;对照组予以安慰剂治疗 4 周。IBS 患者分别于治疗开始前及结束时，各收集粪便样品 1 次。正常对照人群收集粪便样品 1 次。粪便样品收集后立即厌氧保存于-70冰箱内。粪便样本DNA 提取运用 QIA amp DNA Stool Kit(Qiagen,Hilden,Germany)，提取后的粪便 DNA 样品于-20冰箱内保存。所得 DNA 样品通过荧光定量 PCR 检测，与相应外标准品比对，检测其相应细菌 DNA 的拷贝数。表 1 研究对象一般资料1.3 疗效观察 参照 IBS 医疗调查表设计有关胃肠道症状量表，治疗前后由专科医师进行症状评估及评分。1.4 细菌 DNA 测定 参照
11、Malinen 等3 报道，依据双歧杆菌及乳杆菌 16SrDNA 基因序列设计属特异性 PCR 扩增引物对，并在BLAST 基因库内比对引物序列特异性，上下游序列见表 2。引物对由宝生物工程(大连) 有限公司设计，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。荧光定量 PCR 试剂 SYBR Premix Ex Taq 购买自宝生物工程(大连) 有限公司，实验在 LightCycle(罗氏公司) 上完成，每个样品均有空白对照。表 2 双歧杆菌和乳杆菌属特异性引物1.5 统计学处理 采用 SPSS 11.0 统计软件。由于粪便内双歧杆菌及乳杆菌绝对值不呈正态分布，故取其对数值(log10)进行统计分析。
12、计量资料以s 表示，组间均值采用方差分析 (analysis of variance),P0.05 差异有统计学意义。2 结 果2.1 治疗前 IBS 患者与正常人群粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量分析 见表 3。培菲康治疗前,腹泻型 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均少于正常人群(P0.01); 混合型 IBS 患者粪便中双歧杆菌含量少于正常人群(P0.01)，乳杆菌含量与正常人无统计学差异(P0.05);便秘型 IBS 患者及未分型 IBS 患者粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量与正常人群无统计学差异(P0.05)。2.2 治疗前后 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量分析 见表 4、5。由于混
13、合型 IBS 患者及未分型 IBS 患者病例数较少，该部分实验仅包括腹泻型 IBS 患者及便秘型 IBS 患者。IBS 患者治疗后，粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均高于治疗前(P0.01)，而安慰剂组治疗后患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量与治疗前无明显差异(P0.05)。表 3 治疗前 IBS 患者与正常人群粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量与正常组比较：*P0.01 表 4 治疗组治疗前后 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量分析表 5 安慰剂组治疗前后 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量分析(s, log10 拷贝数/g)2.3 治疗前后治疗组粪便中双歧杆菌及乳杆菌数量与治疗效果的关系 见表 6。
14、在腹泻型 IBS 患者中，治疗有效者，治疗后粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量都要少于治疗无效者(P0.01)，而在以便秘为主的 IBS 患者中，没有此类发现。表 6 治疗效果与粪便中益生菌数量的关系 3 讨 论IBS 是临床上最常见的一种胃肠道功能紊乱性疾病，是一组包括腹痛、腹胀,以大便习惯改变为主要特征，并伴大便性状异常，持续存在或间歇发作，而又缺乏形态学及生物化学异常改变等可用器质性疾病解释的临床症状。由于缺乏特异的诊断标准，国际上对该病的诊断标准曾多次修订，于 2006 年公布了最新的罗马诊断标准2，将 IBS 大致分为腹泻型、便秘型、混合型和未分型。据报道不论是西方发达国家还是发展中国家 I
15、BS 的患病率均非常高，我国人群患病率估计在 20%，也有报道在西方国家 IBS 患者占胃肠门诊患者的 25%50% ，在我国约占 40%4。同时随着生活节奏的改变及生活压力的加大，该病的发病率还有上升的趋势。由于 IBS 至今未有明确的病因及发病机制，因此国内外根据动物实验及临床研究提出了许多假说，试图解释该疾病的起因及发病过程，如肠道动力失衡、激素水平、环境基因影响、细菌过度生长、内脏高敏感、脑肠轴调节异常等，但是没有一种学说能完全解释该病的发展过程。同样，IBS 的治疗方法也是多种多样，如缓泻剂、止泻药、中医中药等，但大多都是对症治疗，治疗效果也各不相同。近年来，有研究发现，肠道菌群的变
16、化可能与 IBS 症状产生和持续存在有关5。早期由于细菌培养比较困难，限制了人们对肠道细菌的研究6。随着基因学技术的发展，我们对于肠道细菌的认识在技术及概念上有了飞速的提高，特别是对细菌的分类以及它们的代谢能力和免疫调节能力上的认识，使我们对于肠道细菌在疾病和健康中的作用也有了进一步的了解7。同时，新的分子生物学方法已被用于检测在肥胖或炎症性肠病状态下肠道细菌的变化。目前，虽然大家的观点倾向于认为肠道菌群的变化继发于 IBS 的发生; 但是Lupp 等8在结肠炎的动物模型中发现，无论诱发结肠炎的刺激物是感染还是化学物质，其肠道细菌的变化都是相同的。这个发现提示我们，肠道细菌的组成变化与疾病的表
17、现类型具有相关性，从而证实了肠道细菌的变化可能作为诱因，通过某种作用机制产生疾病。目前对于肠道菌群的研究还有待进一步的深入，随着宏基因组学的发展，我们一定能够确切了解肠道细菌的组成及它们各自的作用9。对于益生菌的认识，早在上世纪初即 1907 年，著名细菌学家梅切尼科夫就提出饮用酸奶可延年益寿的假说。同样在动物实验中10，发现益生菌制剂可以治疗各种肠道功能性或器质性疾病。然而在临床上，关于益生菌治疗效果的数据还不具有说服力。虽然目前认为益生菌制剂对于治疗 IBS 有一定帮助11 ，但是由于个体差异以及益生菌组成的差异，对于益生菌的治疗效果还有待深入的研究。益生菌治疗 IBS 的作用机制，目前尚
18、不明确12 。但有体外实验发现13，某些益生菌可刺激肠黏膜上皮细胞产生某些受体，而该类受体与缓解内脏高敏感性有一定关系。相信随着检测技术的不断发展，我们对于益生菌的作用机制将会有更充分的认识。本组结果提示：腹泻型 IBS 患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均少于正常人群(P0.01)，混合型 IBS 患者粪便中双歧杆菌含量少于正常人群(P0.01); 服用培菲康 4 周后，患者粪便中双歧杆菌及乳杆菌含量均高于治疗前(P0.01); 以腹泻为主的 IBS 患者中，治疗有效者，治疗后粪便中双歧杆菌和乳杆菌含量都要少于治疗无效者(P0.01)。我们人体内有超过 2 000 种共生细菌，其中绝大部分在胃肠道内，而其中我们所熟知的病原微生物只有 100 种左右。传统的观念认为，肠道细菌作用只限于抵御外来病原微生物的入侵，而随着研究的深入，我们发现肠道细菌在食物代谢、免疫应答等多方面均有重要作用，是维持内环境稳态的重要一环。因此充分了解肠道细菌与人体的相互关系将为我们进一步认识某些疾病的发生和治疗该疾病提供有益的帮助。【
