1、第十二章 基因敲除和RNA干涉,内容,第一节 基因敲除,基因敲除（gene knock-out）又称基因打 靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点。,二、基因敲除技术,定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。,1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。,2、利用随机插入突变进行基因敲除,3、RNA干扰也可以引起基因敲除,基因敲除技术与诺贝尔奖,医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们
2、是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授摘自中华医学信息 2007年第22卷第21期,基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲 除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除 细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型 基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。,一、实现基因敲除的多种原理和方法,1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功
3、奠定了基因敲除的技术基础。 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。,步骤,基因载体的构建 ES 细胞的获得 同源重组 选择筛选已击中的细胞 表型研究 得到纯合体,1、条件性基因敲除法,条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法,噬菌体的Cre/Loxp系统、酵母 细胞的FLP/FRT系统，尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛
4、。,2、4诱导性基因敲除法,诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点 几种诱导性类型如下：四环素诱导型(图4)；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型, 诱导基因突变的时间可人为控制； 可避免因基因突变而致死胎的问题 在2 个loxP 位点之间的重组率较高； 如用病毒或配体DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre 的转基因动物的过程。,二、随机插入突变进行基因敲除,细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞
5、 逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除,基因捕获法,最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法 neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达 中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得,基因捕获法的优缺点,建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库 节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用 更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析,第二节 RNA干涉,概念 原理,概念,这种向生物体中导入双链RNA 后,引起生物体内同源基因沉默(
6、silencing) 的现象称作RNA 干涉 自然条件下，RNA 干涉对于抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、生物体的发育和基因表达调控都有重要作用,RNAi阻断基因表达的机理,双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA 双链RNA还能在RdRP 的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA SiRNA的双链解开变成单链，和已知蛋白形成复合物（Argonaute2）结合，复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解， 以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加， 长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA,步骤,设计反向DNA序列 重组载体 转染细胞 检测目的基因表达 观察表型,第三节基因敲除技术的应用及前景,建立生物模型 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 提供廉价的异种移植器官 （半乳糖基转移酶 ） 免疫学中的应用 （抗体） 改造生物、培育新的生物品种,
