1、富含胸腺嘧啶 DNA 传感探针对水体中Hg2+的检测 肖慧 杨婵 赵珍 文家意 刘凤 周银香 徐思嘉 许庭琦 何婧琳 曹忠 长沙理工大学化学与生物工程学院电力与交通材料保护湖南省重点实验室微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心 摘 要： 该工作以富含大量胸腺嘧啶(Thymine,T)核酸单链为识别分子,SYBR Green I(SG)为荧光基团,建立了一种简单、灵敏的荧光增强法检测 Hg2+。由于 T-Hg2+-T 键的形成,富 T 单链自我折叠或者两两配对形成双链 DNA 结构,当溶液中的 SG 嵌入DNA 双链中时,SG 荧光强度显著增强。实验结果表明,SG 荧光强度随着 Hg2+浓度的增
2、加而增加。在最优实验条件下,SG 的荧光强度与 Hg2+的浓度在 4.00010-72.00010-6mol/L 范围内呈线性关系,检出限为 3.90010-8 mol/L。该方法在含 5.0%湘江水实际样品中获得的回收率为 98.72%104.5%,因此该传感器可用于实际湘江水样品中 Hg2+的测量。关键词： 胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶; SG 嵌入剂; 分子识别; 荧光光谱分析; 作者简介：何婧琳,Tel/Fax:0731-85258733;E-mail:jinglin_作者简介：曹忠;基金：国家大学生研究性学习和创新性实验计划课题(201310536009)Thymine rich-D
3、NA sensing probe for Hg2+ detectionXiao Hui Yang Chan Zhao Zhen Wen Jia-yi Liu Feng Zhou Yin-xiang Xu Si-jia Xu Ting-qi He Jing-lin Cao Zhong Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection,Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Powe
4、r and Transportation,School of Chemistry and Biological Engineering,Changsha University of Science and Technology; Abstract： Mercury is one of the most toxic heavy metals that present in environment. Therefore, a sensitive and selective sensing system for mercury detection is highly demanded. This p
5、aper described a fluorescent sensor using a label free Hg2+specific DNA probe(43mer-T18Stem) and an intercalation dye SYBR Green I(SG). As is known to all,Hg2+can specifically interact with thymine base to form strong and stable thymine-Hg2+-thymine(T-Hg2+-T) complexes. This specific T-Hg2+-T format
6、ion affected the hybridization of the Hg2+specific probe and the intercalation of SG. The proposed sensor showed a linear response in the range of 4.00010-72.00010-6mol/L of Hg2+with a detection limit of 3.90010-8mol/L. The sensor revealed good recovery rates from 98.72% to 102.8%, indicating that t
7、he sensing system can be utilized for the determination of Hg2+in real samples.Keyword： thymine-Hg2+-thymine; intercalation dye SYBR Green I; molecular recognition; fluorescence spectroscopy; 0 引言近年来汞污染成为威胁动物及人类健康的一种重要方式,它来源于天然和人为活动,如火山爆发,采矿业,皮革鞣制和电镀等1。 因汞是一种毒性很强的元素, 人体吸收环境中的汞之后, 通过生物富集作用和食物链传递,进入人体
8、内部, 特别是中枢神经系统和内分泌系统, 导致各种疾病2。 当进入血液后,首先会同血液中的血浆蛋白或血红细胞结合, 然后分布到肾脏与脑部,最后再分布到心、肺、肝、肠壁等处,而且对呼吸道、 消化道也会有一定影响。 由于汞元素对身体存在着极大的危害性,世界卫生组织把汞列为首要考虑的对环境有危害的污染物3。 汞中毒一般是由汞离子引起的, 由于它参与一些重要的生物反应, 如和人体蛋白的巯基络合形成金属蛋白,从而抑制了酶活性,使人体的肝脏和肾脏等受到损害,引起尿毒白、血尿等病变,因此汞已被广泛认为可危害动物物种包括人类健康的重要来源4。Thymine- Hg- Thymine (T- Hg-T) 这种结
9、构在近几年引起研究者们的广泛关注,T-T 能与 Hg 特异性结合形成稳定的 T- Hg-T 结构 ,将 T 作为识别基团通过一定的连接体将其与信号转导基因连接起来就可以构建有机小分子 Hg 传感器5。 T-T 错配对汞离子有很高的选择性,而且 T- Hg-T 结构稳定性比匹配的 A-T 结构的稳定性高6-8。 例如 :Bin Liu 等9利用 Hg 不存在时, 5-18T-3 与 5-18A-3 由于碱基互补形成双链结构,加入荧光基团 SYBR Green I,荧光信号减弱。 标记核酸适体被广泛运用到基于 T- Hg-T 结构的 Hg2+检测中10-11, 例如 :Ono 等10利用一条两端分
10、别修饰了荧光基团和猝灭基团的 DNA 探针,在 Hg存在时,形成 T- Hg-T 结构 , 荧光基团与猝灭基团相互靠近并发生荧光共振能量转换,使得荧光被猝灭。 还有很多传感平台被用来检测 Hg, 如基于聚合物12、小分子作为荧光基团13、DNA -zymes14、 抗体15、 脂质体16等化学生物传感器。 由于基于核酶的荧光传感器快捷方便、分子结构易于修饰、重金属离子效应和灵敏度高等优点,引起研究者们的兴趣,但基于核酶荧光传感器大多数需要对核酸进行荧光标记, 使得实验样品处理繁杂且花费较高17-18,而且对核酸的标记可能导致合成过程中 DNA 损伤,使其对 Hg 的结合能力减弱,因此开发免标记
11、荧光方法检测 Hg 显得较为必要。实验设计了一种基于 T-Hg-T 结构和荧光增强的 Hg 传感器, 利用 Hg 存在时 ,43mer-T18stem 与 Hg 形成稳定的 T-Hg-T 结构 , 加入可嵌入 DNA 双链的 SYBR Green I 时, 得到较强的荧光信号。 Hg 不存在时 SYBR Green I 与单链 43mer-T18stem 结合较弱,荧光信号较弱 。 该方法操作简单、价格低廉、选择性高,为快速检测 Hg 提供了一种新途径。 这个新策略还可提供多通道检测、分子组装、分子逻辑门的研究方法19-22。1 实验部分1.1 试剂核酸适体探针序列见表 1, 购买于生工生物工
12、程(上海)有限公司;SYBR Green I(SG,20)购于上海捷瑞生物工程有限公司;氯化钠、硝酸钠、 硝酸钾、硝酸、三羟甲基氨基甲烷购自于湖南化学试剂厂,均为分析纯级别。表 1 核酸适体探针序列 Tab.1 The sequence of the DNA probes 下载原表 1.2 实验方法1.2.1 核酸适体探针溶液的配制配制含有 1.00010mol/L Na NO3、5.00010mol/L KNO 3的 2.00010mol/L Tris-HNO3溶液, 用 PHSJ-3F 型实验室 p H 计 (上海雷磁仪器厂) 将 p H 调至7.4。 将此溶液作为 43mer-T18st
13、em 的缓冲液。 用相同的方法配置 55mer-stem溶液。 实验配备非生物试剂所用水均为超纯水,配备生物试剂所用水及实验器皿均用手提式压力蒸汽灭菌器(新丰医疗器械有限公司,浙江)进行高温高压灭菌,冲洗所用水均为蒸馏水。1.2.2Hg 溶液的配制配制 1.00010mol/L Hg(NO3)2溶液,用 p H= 7.4 的 Tris-HNO3溶液稀释至所需浓度。 同样方法分别 配制 p H=5、p H=6、p H=8、p H=9 的 TrisHNO3溶液稀释至所需浓度。1.2.3Hg 的检测43mer-T18stem(15 L,5.00010mol/L)和特定浓度的 Hg 在 1 m L 离
14、心管中混合, 将混合液置于室温下反应 30 min 后, 加入 1 L 20SG 混合均匀,最后在激发光和发射光的狭缝宽度分别为 5.0 nm 和 10.0 nm,激发波长为 495 nm,发射光强度在 494620 nm 范围的 LS-45 (美国 Perkin Elmer 公司) 荧光分光光度计对混合液的荧光强度进行扫描。 空白样品 43mer-T18stem (15 L, 0.500 mmol/L) 和 84 L p H 为 7.4 的 2.00010mol/L Tris -HNO3缓冲溶液在 1 m L 离心管中混合。 所有检测均在室温下完成。2 结果与讨论2.1 基本原理实验原理如图
15、 1 所示, 富含 18 个胸腺嘧啶 (T) 的单链 DNA 在 Hg 存在的条件下由于二者的特异性识别作用可形成稳定的 T-Hg-T 结构,当加入 SYBR Green I(SG)后,可以观察到明显的荧光信号。 这是因为当 Hg 存在时,该单链寡聚核苷酸与 Hg 特异性结合形成类似杂交双链 DNA 的复合体 ,当双链嵌入剂 SG 嵌入该复合体内,荧光增强。 而 Hg 不存在时,SG 与单链寡聚核苷酸 43mer-T18stem 结合荧光较弱 ,甚至没有 , 故荧光信号较弱。图 1 发夹探针传感方法荧光检测 Hg 的原理图 Fig.1 Schematic illustration of the
16、 43mer-T18stem probe sensing method for the detection of Hg 下载原图2.2 55mer-stem 和 43mer-T18stem 核酸探针的选择不同单链 DNA 探针与 Hg 结合能力 不一样,为了得到最佳的信背比,选择能够形成最佳 T-T 错配双链 DNA 的探针序列 , 实验考察了两种不同 的核酸 DNA 链55mer-Stem 和 43mer-T18Stem 对 Hg 的响应。 在 55L 1.00010mol/L Hg15 L 5.00010mol/L 的 DNA 链探针及 1 L 0.2conc. SG 条件下, 按照 Hg
17、的检测方法, 探索表 1 中不同 DNA 链探针的荧光强度变化, 空白样用 Tris-HNO3代替。 结果如图 2 所示,从结构上分析,55mer-Stem 是一条含 55 个碱基的核酸链,其中 T-T 结合的序列为 26 个,加入 Hg 后形成 T-Hg-T 结构,信背比为0.3839。 43mer-T 18Stem 中 T-T 结合的序列增多,加入 Hg 后形成 T-Hg-T 结构更多 ,SG 更易于嵌入双链中 ,荧光强度明显增强,信背比为 0.9911。 因此,实验选 43mer-T18Stem 探针来完成接下来的实验。2.3 传感体系制作过程荧光光谱考察为了考察传感体系中各组分的荧光性
18、质,实验对各组分的溶液进行了荧光检测。 实验结果如图 3,当溶液中只加入 SG(曲线 a)时的荧光强度为 55.70,表明 SG 本身具有微弱的荧光特性。 当 1.000 10mol/L Hg 存在时(曲线 b)的荧光强度为 42.97, 曲线 b 的荧光强度比曲线 a 的荧光强度略低, 表明 Hg 对 SG 本身具有微弱的荧光淬灭作用。 当溶液中只有 43mer-T18Stem 时,荧光强度很微弱(曲线 c),即 60.05;这是因为 43mer-T18Stem 链本身也 有微弱荧 光 。 而在 43mer T18Stem 溶液中加 入 SG 时 , 荧光强度 增大到 309.3 ( 曲线
19、d), 该文课题组推测 , 这是因为 43mer -T18Stem 会发生自 身的部分 折叠而导 致的 。 当1.000 10mol/L Hg 存在时 ,43mer-T 18Stem/SG 传感体系的荧光强度为 563.9 ( 曲线 e),这表明富含 T 碱基的 43mer-T18Stem 链与 Hg 能特异性的结合形成 T-HgT 稳定结构 , 使 SG 更容易嵌入到 T-HgT 结构中, 发出强的荧光信号。 因此,该传感体系可以用于 Hg 的检测。图 2 核酸链 1 和核酸链 2 两种探针在空白和 1.00010mol/L Hg 溶液中的荧光发射光谱图 Fig.2 Fluorescence
20、 spectra of 55mer-Stem and 43merT18Stem probes in the absence or presence of Hg. The 下载原图图 3 荧光染料(a)、荧光染料+汞离子(b)、核酸链 1 (c) 、 核酸链 1+荧光染料(d)、核酸链 1+荧光染料+汞离子(e) 的荧光光谱图。 其中荧光染料的浓度是 0.2conc Fig.3 Fluorescence spectra of the following solutions. SG (a); the mixture of Hg2+and SG(b); 43mer-T18Stem (c); the
21、mixture of 43mer-T18Stem and SG in the absence (d) or presence (e) of Hg2+. The concentration of SG was 0.2conc2.4pH 值的优化为了考察 p H 值对检测体系的影响, 在传感器分别 对 Tris-HNO3的 p H 为5.0、6.0、7.4、8.0、 9.0 时的荧光进行比较。 由图 4 可知,空白样的荧光强度随着 p H 值变化很小, 而目标 Tris-HNO3的荧光强度呈现先增大后减小的趋势。 当 Tris-HNO3的 p H 为 7.4 时,信背比最大,因此,p H=7.4
22、是最佳的反应条件,在此条件下 Hg 能更好的形成 T-Hg-T,从而达到最佳的荧光增强效果。图 4 核酸链 1/荧光染料体系在空白和 1.00010mol/L Hg 溶液中随 p H 变化的荧光响应图 Fig.4 Fluorescence responses of 43mer-T18Stem/SG 下载原图2.5 培育时间的优化为了考察培育时间对检测体系的影响,在 1.00010mol/L Hg、43mer-T 18Stem及 0.2conc. SG、Tris-HNO 3p H 为 7.4 的条件下 , 分别调整培育时间为 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。
23、 如图 5 所示,在空白实验中,培育时间对于荧光响应的影响不大。 在检测 1.00010mol/L Hg 时,当培育时间从 10 min 到 30 min 时,目标样品的荧光强度随着培育时间的增大而增大,30 min 之后则随着培育时间的增大而荧光响应减小。 因此,实验的最优培育时间为 30 min。图 5 核酸链 1 与 Hg 及 Tris-HNO3 在不同反应时间 (10、20、30、40、50 min)下与荧光强度响应图 Fig.5 Time course of incubating proposed sensor (10 min, 20 min, 30 min, 40 min and
24、50 min) in the absence or 下载原图2.6 分析性能实验在最佳的条件下,对不同浓度的 Hg 进行了定量检测。 如图 6(A)所示,能观察到荧光强度随着 Hg 浓度在 4.000102.00010mol/L 的范围内增加而增加,这是因为随着 Hg 浓度的增加,T-Hg-T 稳定结构越来越多,嵌入的 SG 也增多,所以荧光强度增大。 图 6(B)为 Hg 浓度与荧光强度的线性关系图, 选择 SG 的最大发射波长 525 nm 处的荧光强度为定量依据并有良好的响应,且荧光强度与 Hg浓度之间的线性关系为 F=0.4744cHg+72.50, 其中 r=0.9874, 线性范围
25、是4.000102.000 10mol/L, 检出限为 3.90010mol/L。图 6 (A) 核酸链 1 探针传感体系对一系列浓度 Hg(从下至上 :4.00010、6.00010、7.50010、 1.00010, 1.50010 和 2.00010mol/L)的荧光光谱图 ;(B) 荧光强度与 Hg 浓度标准曲线图 Fig.6 (A) Fluorescence spectra of 43mer-T18Stem with various concentrations of Hg(from bottom to top: 下载原图2.7 干扰离子的影响在最优实验条件下, 考察常见的金属离子
26、K、Zn、Cu、Pb、Fe 对 Hg 检测的干扰程度,在没有 Hg 存在的条件下,检测 K、Zn、Cu、Pb、 Fe 的荧光强度。 结果如图 7 所示:各金属离子对传感体 系的荧光 强度影响 非常小 , 而目标物 Hg 存在时的荧光响应值最高, 也就是说 SG 对 Hg 有特异的选择性。 说明该方法对Hg 有良好的选择性。2.8 回收率的测定在最优实验条件下,将湘江水用缓冲溶液稀释 20 倍,制成含有 5%湘江水的实际水样。 滴加 Hg 标准溶液,浓度分别为 4.00010、6.00010、 7.500 10、1.000 10、1.500 10 和 2.00010mol/L,测定各溶液的荧光强
27、度 ,根据线性方程算出 Hg 含量,计算回收率(如表 2 所示),测得的回收率为98.72%104.5%,因此该传感器可用于实际水样中 Hg 的测量。图 7 传感探针检测干扰离子和 Hg2+的荧光光谱图 (从上至下 :Hg2+, blank, Cu2+, Zn2+, Fe3+, Pb2+, K+) Fig.7 The fluorescence spectra of the proposed sensor in different metal ion solutions (from top to bottom:Hg2+, blank, Cu2+, Zn2+, Fe3+, Pb2+and K+)C
28、u, Zn, Fe, Pband K)3 结论该文利用 T-T 与 Hg 特异性作用形成稳定的 T-Hg-T 结构与 DNA 嵌入剂 (SG) 设计了一种新型的汞离子荧光传感器。 利用荧光染料 SG 嵌入双链 DNA 能产生较高荧光的作用, 在不同浓度下 Hg 对传感体系的响应做了荧光定量分析。 在最优实验条件下,汞()离子浓度与荧光信号值在 4.00010mol/L 2.000 10mol/L 范围内呈线性关系, 最低检测浓度为 3.90010mol/L。 该方法对汞()表现出较好的选择性,可用于实际环境水样中汞()的灵敏检测,在设计上具有普遍应用性且不需要预处理,可直接进行测定,操作简单、价格低廉,整个操作过程绿色、 环保,且检测响应快速,选择性良好,具有良好的应用前景。表 2 回收率的测定 TTaabb.22 RReeccoovveerryy ooff HHggiinn RReeaall SSaammppllees s 下载原表
