1、基于分子生物学技术的吸血节肢动物血餐宿主鉴定方法研究概述 刘营 孙继民 凌锋 卢苗贵 施旭光 任江萍 张蓉 陈恩富 浙江省疾病预防控制中心传染病预防控制所 摘 要： 吸血节肢动物作为虫媒传染病的重要传播媒介, 其宿主的确定对理解虫媒传染病生态学及采取进一步的防控措施具有重要意义。血餐鉴定策略是识别节肢动物宿主的有效方法, 随着分子生物学技术的发展, DNA 检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性, 常用的分子生物学方法有 PCR、DNA 序列测定、异源双链分析、限制性片段长度多态性分析、反向线点杂交技术和 DNA 指纹图谱等。通过对分子生物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及优缺
2、点进行综述, 以期为相关虫媒疾病防控提供参考。关键词： 聚合酶链式反应; 基因扩增测序; 反向线点杂交; 节肢动物; 血餐; 作者简介：刘营, 男, 硕士, 医师, 主要从事自然疫源性疾病防治工作, Email:liuying_作者简介：陈恩富, Email:收稿日期：2017-06-15基金：浙江省医药卫生科技计划 (2017KY291) Study of identification methods for arthropod bloodmeal donor based on molecular biologyLIU Ying SUN Ji-min LING Feng LU Miao-gu
3、i SHI Xu-guang REN Jiang-ping ZHANG Rong CHEN En-fu Zhejiang Center for Disease Control and Prevention; Abstract： Hematophagous arthropods are important vectors for vector-borne diseases. The identification of hematophagousarthropods hosts is critical to exploration of vector-borne disease ecology a
4、nd further control measures. The strategy ofbloodmeal identification is effective to ascertain arthropod hosts. With the development of molecular biology technology, DNA-based methods, which include PCR, DNA sequencing, restriction fragment length polymorphism, reverse line blothybridization, and DN
5、A fingerprinting, enhanced the specificity and sensitivity of hematophagous arthropod bloodmealidentification greatly. This paper reviewed the principles, advantages and disadvantages of molecular protocols for detectionof host DNA, which might help to provide reference for the prevention and contro
6、l of related vector-borne diseases.Keyword： Polymerase chain reaction; DNA sequencing; Reverse line blot hybridization; Arthropods; Bloodmeal; Received： 2017-06-15我国丰富的气候条件、地理景观和生态环境孕育了多样性的病原、宿主动物和病媒生物, 导致病媒传播疾病广泛分布和频繁发生, 在我国法定报告传染病中约 1/3 的疾病是由病媒生物作为媒介传播的1-2。吸血节肢动物作为重要的病媒生物, 在其叮咬宿主获取血餐的过程中可传播多种病原体 (
7、如病毒、立克次体、细菌、螺旋体和原虫等) , 并可引起人森林脑炎、肾综合征出血热、莱姆病、疟疾、登革热、发热伴血小板减少综合征等自然疫源性疾病3-4。吸血节肢动物血餐宿主的确定对了解病原体在自然界的保持和循环, 如确定贮存宿主、理解病原体-媒介-宿主的交互作用以及采取相应的控制措施或评价媒介控制措施的效果等具有重要的参考价值5-7。历史上节肢动物血餐宿主鉴定常采用血清学方法, 如环状沉淀试验、免疫扩散试验、ELISA 等, 血清学试验在血餐宿主研究中也提供大量数据和线索, 但也存在很大局限性:要求血餐相对新鲜、量较大;相近物种间易产生抗体交叉反应, 呈现假阳性结果, 血餐宿主鉴定水平通常只能达
8、到目或科等较高分类阶元, 特异性较差;需预先制备待查宿主动物的抗血清, 耗时长、操作复杂, 无法鉴定未知的潜在宿主6-8。随着分子生物学技术的发展, 基于线粒体 DNA (mitochondrial DNA, mt DNA) 、核基因及核糖体基因序列差异的 DNA 检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性, 血餐宿主鉴定提高到种, 甚至是个体水平, 许多节肢动物的吸血行为被重新认定6。常用的分子生物学方法有特异性 PCR、实时荧光PCR (Real-time PCR) 、DNA 序列测定、限制性片段长度多态性分析、异源双链分析、反向线点杂交技术和 DNA 指纹图谱等6,9。现就分子生
9、物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及应用进行综述, 以期为相关虫媒传染病防控提供参考。1 PCR基于 PCR 方法的蚊虫、锥蝽、蜱、库蠓属等节肢动物血餐宿主鉴定已有报道, PCR 技术的敏感性和特异性均高于血清学方法, 尤其建立的可针对不同物种的特异性多重 PCR, 因具有价廉、快速等特点有巨大的潜在应用价值, 国内外对此开展过较多研究10-14。线粒体细胞色素 b (cytochrome b, Cytb) 基因是常用的分子标志, 根据血餐宿主物种间 Cytb 基因序列的差异设计特异性引物, 使该引物只能在特定的血餐宿主中扩增出特定长度的片段, 通过扩增片段的有无鉴定节肢动物胃血来源, 如
10、 Ngo 和 Kramer15通过设计的 5 种目水平特异性引物成功区分了饱血蚊胃血样本中的哺乳动物血餐以及 4 种鸟源血餐16。Kirstein 和 Gray17在实验室条件下让蓖子硬蜱 (Ixodes ricinus) 幼蜱叮咬小鼠, 以 Cytb 基因作为诊断标记, 通过普通 PCR 可有效扩增饱血后 10 d 内宿主靶基因, 但进一步设计的巢式 PCR 则可将鉴定时间延长到蓖子硬蜱饱血后200 d。在各物种特异性引物建立的基础上, 一些研究者开始探索通过多重 PCR方法实现节肢动物多宿主的混合血餐检测。Garros 等18设计了 7 种家畜和 3种野生动物种水平特异性引物, 应用多重
11、PCR 方法对饱血库蠓属昆虫的多食性进行了研究。张井巍等19在研究传疟媒介按蚊的嗜血习性时, 针对犬、猪、牛、人的 mt DNA Cytb 设计了特异性引物, 应用多重 PCR 法对云南省部分地区按蚊胃血标本进行鉴定, 结果显示该法能较好地鉴定现场捕获的按蚊胃血源。与普通 PCR 比较, Real-time PCR 在血餐宿主鉴定中具有较高灵敏度, 对于因消化或储存导致部分降解的血餐标本也能较好地鉴定;操作相对简便, 不需对产物进行凝胶电泳, 且闭管操作不易受污染等9,20-21。Sales 等22在研究白蛉亚科血餐时, 以犬、猫、马、鸡、黑鼠和人线粒体 Cytb 基因保守区为靶区域, 建立的
12、 Real-time PCR 检出限可达 0.110.0 pg DNA。为进一步提高该方法的检测效率, Woods 等23使用多色荧光标记建立多重实时荧光定量 PCR 应用于猫栉首蚤 (Ctenocephalides felis) 血餐宿主的研究中, 而且该方法检测灵敏度较高 (4.5450.0 fg 样本 DNA) 24。基于 PCR 方法在研究吸血节肢动物特定血餐宿主时可作为很好的选择, 可以实现一次扩增即能判定血餐样本是否属于目标物种, 具有检测灵敏度较高、特异性好、检测效率高、操作简便和出结果快的优势。但多重 PCR 条件优化难度大, 需设计潜在血餐宿主的特异性引物, 在血餐宿主鉴定中
13、适用范围受限, 同时对于未知的血餐宿主难以鉴定22。2 基因扩增测序基因扩增测序技术是节肢动物血餐宿主鉴定中最直接、特异的方法。该方法先利用通用引物对血餐中宿主残留靶基因进行扩增, 然后进行测序, 并将其序列在基因库中进行同源性比对或系统进化分析, 进而鉴别血餐来源于何种动物。Pierce 等25通过巢式 PCR 扩增了反刍动物 mt DNA Cytb 基因并进行序列测定, 进而鉴定美洲花蜱 (Amblyomma americanum) 的吸血动物 (反刍动物) 来源。Graham 等26为提高基因扩增测序技术的灵敏度, 以线粒体 12S r RNA 基因为诊断标记, 应用实时荧光定量 PCR
14、 扩增结合测序方法鉴定蚤中脊椎动物血餐, 该方法结合了实时荧光定量 PCR 的灵敏性和测序技术的特异性使得蚤血餐宿主鉴定部分达到种水平。Logue 等27分别以哺乳动物 16S r RNA 基因和人 mt DNA 高变区作为诊断标记, 应用高通量测序方法对巴布亚新几内亚部分地区捕获的疟蚊血餐进行鉴定, 结果显示哺乳动物中人、猪、犬为当地疟蚊的主要宿主, 16.3%的蚊胃血标本为混合血餐, 且人源血餐中 4.9%取食于不同个体。Hebert 等282003 年首次提出了以线粒体 DNA 细胞色素 C 氧化酶亚基 (cytochrome C oxidase subunit, CO) 为主要诊断标记
15、, 利用通用引物扩增待测物种的 mt DNA CO基因片段, 并将目的序列和生命 DNA 条形码数据库中的参考序列进行比对分析, 可实现快速准确的物种鉴定及新种识别, 即 DNA条形码技术 (DNA barcoding) 29, 该技术在节肢动物血餐宿主鉴定中被证明行之有效, Alcaide 等30、Gariepy 等31已用该方法鉴定了蜱脊椎动物宿主。基因扩增测序技术在血餐宿主鉴定中具有特异性高的优点, 尤其在探求未知宿主及鉴定多宿主来源血餐上具有明显优势, 鉴定的特异性可达个体水平。但对部分降解、残留 DNA 量较少的血餐样本的鉴定其灵敏度还有待提高;对于混合血餐, 通常需对基因扩增产物进
16、行克隆后测序;相比其他方法基因测序费用也较高, 不适用于大规模血餐样本的鉴定6,32-33。3 异源双链分析 (heteroduplex analysis, HDA) HDA 因在基因突变检测中具有高灵敏度, 常被用于遗传筛查, 因其可发现 DNA序列中的微小差异, 在近缘物种的鉴定中具有一定优势34。HDA 用于节肢动物血餐宿主鉴定的主要原理是基于 DNA 分子的变性、复性过程, 首先在 PCR 中采用同一对引物, 选取具有一定同源性的目的片段作为异源双链驱动子 (driver) 与血餐宿主相应靶基因进行混合, 从不同来源扩增得到的 DNA 片段经变性、复性后形成同源、异源双链, 因异源双链
17、中碱基错配或不配导致分子构象发生改变, 在非变性 PAGE 中相同长度 (也可稍有差别) 的同源和异源双链在凝胶中的迁移率不同, 且异源双链同源性越高泳动越快, 通过与待查宿主及驱动子形成的异源双链参照图谱比较从而达到鉴定目的35-37。1999 年 Boakye等34首次应用 PCR-HDA 方法开展了黑蝇 (Simulium damnosum s.l.) 、舌蝇 (Glossina palpalis) 的血餐宿主研究, 其脊椎动物宿主鉴定分类单元达到属水平。Lee 等37在研究北美地区蚊属鸟源血餐时对该方法进行了优化使得鉴定分类单元提高到种水平。Bosseno 等10将 HDA 与多重 P
18、CR 结合起来研究墨西哥部分村庄锥蝽的吸血来源及克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi) 感染状况, 该检测技术的联合应用可有效研究人感染途径以及克氏锥虫在自然界中的传播循环。HDA 基于对凝胶图谱的解读, 因多宿主混合血餐理论上会产生 (N+1) (N 为血餐宿主种类) 种同源或异源双链, 使得鉴定更为复杂, Bosseno 等382009年在 HDA 基础上联合应用克隆测序方法对锥蝽多食性进行研究, 使得混合血餐的鉴定有了相对经济有效的方法35,37。HDA 电泳图谱中出现参照图谱不能解释的谱带时, 提示潜在的未知宿主存在, 可通过进一步的 DNA 测序进行鉴定, 并可将新谱带纳入
19、参照图谱中以扩大可检测的宿主范围34。HDA 在血餐宿主鉴定中也存在技术局限性, 首先若探究节肢动物血餐宿主需制定大范围潜在宿主参照图谱;单纯使用 HDA 对大样本量和混合血餐的鉴定较为复杂;其灵敏度受碱基错配类型以及凝胶基质、厚度、缓冲液、电泳电压等实验条件影响, 不同研究中可比性较差以至于无法创建通用的参照图谱库10,33,39。4 限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) RFLP 技术是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的, 该方法首先通过 PCR 扩增血餐宿主目的基因, 然后根据不同种间宿主动物
20、靶基因序列信息的多态性选择合适的内切酶或内切酶组合酶解样品 DNA, 从而得到大量的限制性酶切片段, 经凝胶电泳后根据种属特异性的酶切图谱达到物种鉴定目的6。目前已有应用PCR-RFLP 方法鉴定硬蜱、舌蝇、按蚊、锥蝽血餐宿主的报道, 在这些研究中常用的目的基因有 mt DNA Cytb、12S r RNA、16S r RNA 基因等17,40-42。Kirstein 和 Gray17通过对小家鼠 (Mus musculus) 、绵羊 (Ovis aries) 、黇鹿 (Dama dama) 和家牛 (Bos taurus) 4 种动物 mt DNA Cytb 基因的种特异性酶切位点多态性分析
21、, 筛选出 Hae+Dde的内切酶组合, 可分辨出隶属于7 科 (鼠、犬、牛、仓鼠、兔、鹿和雉科) 11 种动物中的 10 种 (鹿科的马鹿和梅花鹿无法鉴定) , 肯定了 RFLP 技术在血餐宿主鉴定中的潜在应用价值。Oshaghi 等41在斯氏按蚊 (Anopheles stephensi) 血餐研究中基于 Cytb 基因酶切多态性, 选取 Xho和 Taq内切酶对斯氏按蚊潜在宿主人、牛、绵羊、鸡和豚鼠进行了鉴定, 认为 Cytb 基因能够表现出足够的种间多态性, 若针对特异性的人 mt DNA 高突变区进行扩增, 也可使节肢动物血餐宿主鉴定达到个体水平。Roellig 等40通过特异性扩增
22、哺乳动物残留 DNA, 应用该技术对美洲锥虫病传播媒介锥蝽的多宿主混合血餐进行了鉴定。RFLP 技术具有简便、经济等优点, 而且由于限制性内切酶识别序列具有专一性, 因此具有较高的可靠性。但在目的片段含有的可显示种属间差别的酶切位点并不多、可提供的多态性信息量有限的情况下, 不得不选择多种限制性内切酶, 这不仅耗时和成本显著提高, 而且还使操作变得繁琐及增加污染和错误的概率43-44。末端限制性片段长度多态性 (terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP) 技术的基本反应原理与 RFLP 相似, 不同之处在于使用了荧光标记
23、 PCR 产物45。Meece 等33通过荧光标记引物扩增 69 种 (55 种鸟类、13 种哺乳类和 1 种两栖类) 动物一段长为 358 bp 的 Cytb 片段, 基于可检索数据库成功鉴定了 50 只蚊胃血餐来源。T-RFLP 的优点在于重复性好, 高通量、自动化程度高, 可与现有数据库进行对比。由于产生末端限制性片段的设备为 DNA 测序仪, 所以精确度和分辨率较高, 但与 RFLP 比较完成实验所需设备要求较高, 试剂价格也较昂贵42。5 反向线点杂交 (reverse line blot hybridization, RLB) RLB 是一种将 PCR、核酸杂交、光化学反应三者融为
24、一体并可用于大样本、多通道的生物芯片诊断技术46-47。在节肢动物宿主鉴定中, 它采用多位点固化了已知物种特异性寡核苷酸探针的膜条与扩增的血餐宿主靶序列杂交, 经光化学反应 (生物素-标记酶的亲和素-显色剂) 通过不同位置的杂交信号进行鉴定, 具有良好的敏感性、特异性, 且操作简单、成本低廉以及结果易判读等特点46-48。有些研究人员已用该方法成功地鉴定了欧洲蓖子硬蜱及北美美洲花蜱 (Amblyomma americanum) 的血餐宿主49-51。Kirstein 和 Gray17以长 95 bp 的 Cytb 基因片段作为诊断标记, 设计了小家鼠、绵羊、黇鹿和家牛物种特异性探针并选取叮咬小
25、家鼠的蜱作为研究对象, 验证了 RLB 技术在蓖子硬蜱血餐宿主鉴定中的特异性可达种水平。Pichon 等12,51对该方法进行了改进, 选取较为保守的 18S r RNA 基因作为诊断标记, 设计的引物扩大了可扩增的宿主范围, 对游离蓖子硬蜱的病原体和宿主 DNA 进行了鉴定, 特异性到鸟类的目、啮齿类的属级、反刍亚目水平, 集中鉴定了几十个不同的脊椎动物分类单元和病原体。Moran 等50、Humair 等52两个研究组以 12S r DNA 作为诊断标记, 在扩大了可扩增宿主范围的同时使蓖子硬蜱血餐宿主鉴定的特异性提高到种、属水平。Abbasi 等8选取 Cytb 基因作为诊断标记对白蛉血
26、餐宿主进行鉴定, 认为 RLB 技术比 RFLP 和 DNA 扩增测序技术的灵敏度高, 对于潜在宿主种类有限的环境 (如人栖环境、干旱地区) 适合应用 RLB 技术进行节肢动物血餐宿主鉴定。但对宿主范围较广, 需设计大量的物种特异性探针, 并且需要根据实际情况对杂交温度、时长、探针浓度和模板浓度等进行优化, 有可能出现交叉杂交的现象8,53。对于潜在宿主基因序列未知的情况也无法设计特异性探针, 使得该方法在节肢动物血餐宿主探究中也存在一定的限制性。6 其他方法DNA 指纹图谱 (DNA fingerprinting) 是建立在基因组小卫星或微卫星 DNA 分子标记基础之上的, 基于分布广泛、高
27、度多态的串联重复序列, 所以在物种鉴定中其最大优点是可将分类单元提高到个体水平54-56。1985 年 Jefferys 首先将 DNA 指纹技术应用于法医鉴定, 1990 年 Coulson 等57应用该技术研究了冈比亚按蚊 (An.gambiae) 人源血餐宿主, 开启了利用 DNA 指纹图谱技术鉴定节肢动物血餐宿主的先河。Ansell 等58对该方法进行了改良, 选用 5 种人微卫星标志引物进行 PCR 扩增, 产物经 PAGE, 结果直接由计算机自动分析、显示, 减少了用放射自显影所需时间及目测条带所造成的误差。蛋白质鉴定策略由于其高可靠和高效率而被广泛应用于蛋白质组学研究中59, W
28、ickramasekara 等60基于蛋白质组学的质谱法鉴定了蜱血餐中残留的宿主特异性蛋白, 该方法具有高灵敏度, 但对设备的要求及费用也较高, 而且目前还没有潜在宿主的特征蛋白库, 对大范围宿主的研究可行性不高。7 展望基于分子生物学技术的血餐宿主鉴定方法的建立和应用在病媒传播疾病生态学及防控策略研究中具有较大的价值。国外就分子生物学技术在吸血节肢动物血餐宿主鉴定中已开展较多研究, 而国内相关研究较少, 仅局限于 PCR 技术在传疟蚊媒中的研究, 且不同地区、不同生境条件下节肢动物宿主迥异, 不能直接利用国外相关研究数据指导国内虫媒传染病防控, 所以利用分子生物学方法研究节肢动物血餐宿主在我
29、国具有广泛的应用前景。虽然不同方法在灵敏度、特异性、操作、费用、数据处理上各有优点, 但也难以摒弃各自的局限性, 如需要对其反应体系进行优化、所需仪器较昂贵以及对有些物种灵敏度不高等。随着分子生物学技术的发展, 这些方法都结合了相应的技术来弥补自身的不足, 如结合荧光技术提高灵敏度及检测效率, 结合直接 PCR 缩短检测时间, 结合DNA 测序提高检测精准度等, 检测技术的联合应用使得其在实际应用中发挥着重要作用。因此, 在节肢动物血餐宿主鉴定实际应用中可根据研究目的及实验条件, 综合选择适宜的方法, 从而得到更准确可靠的鉴定结果。参考文献1刘起勇.我国病媒生物监测与控制现状分析及展望J.中国
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