1、3 灭菌制剂与无菌制剂3.1 概述3.1.1 基本概念3.1.1.1 灭菌和灭菌法(1)灭菌：系指用物理或化学等方法杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的手段。（2）灭菌法：系指杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的方法或技术。3.1.1.3 无菌和无菌操作法(1)无菌：系指在任一指定物体、介质或环境中；不得存在任何活的微生物。(2)无菌操作法：系指在整个操作过程中利用或控制品避免被微生物污染的一种操作方法或技术。 3.1.1.3 防腐和消毒 (1)防腐：系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段，亦称抑菌。对微生物的生长与繁殖具有抑制作用的物质称抑菌剂或防腐剂。(2)消
2、毒：系指用物理或化学方法杀灭或除去病原微生物的手段。对病原微生物具有杀灭或除去作用的物质称消毒剂。3.1.1.4 灭菌制剂: 系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。3.1.1.5 无菌制剂:系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢一类药物制剂。3.1.1.6 种类 药物制剂中规定的无菌制剂包括：注射用制剂，如注射剂、输液、注射粉针等；眼用制剂，如滴眼剂、眼用膜剂、软膏剂和凝胶剂等；植入型制剂，如植入片等；创面用制剂，如溃疡、烧伤及外伤用溶液、软膏剂和气雾剂等；手术用制剂，如止血海绵剂和骨蜡等。3.1.2 灭菌和无菌操作法3.1.
3、2.1 物理灭菌法 （1）干热灭菌法 一般不采用（2）湿热灭菌法 蒸气比热大，穿透力强，容易使蛋白变性，同时还有作用可靠，操作简便等优点，所以是制剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法。 热压灭菌法 本法一般公认为最可靠的湿热灭菌法。热压蒸气以 1520分钟，能杀灭所有细菌增殖体和芽胞。热压灭菌用的灭菌器种类很多，但其基本结构大同小异。热压灭菌器密闭耐压，有排气口安全阀，压力表和温度计等部件。卧式热压灭菌柜，是一种大型灭菌器，全部用坚固的合金制成，带有夹套的灭菌柜内备有带轨道的格车，分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表两只，一只指示蒸气夹套内的压力，另一只指示柜内室的压力。两压力表的中间为温度表，灭菌柜
4、底部装有排气口，在排气管上装有温度探头，以导线与温度相联。国内现已经生产一种有冷却水喷淋装置，灭菌温度与时间采用程 序控制的新型热压灭菌器。 热压灭菌器使用时应注意的问题： A 灭菌器的构造、被来菌物体积、数量、排布均对灭菌的湿度有一定影响，故应先进行灭菌条件实验，确保灭菌效果。 B 必须将灭菌器内的空气排出。如果灭菌器内的空气存在，则压力表上所表示的压力是器内蒸气和空气二者的总压而非单纯的蒸气压力。结果压力虽然到达预定的水平，但温度达不到。 C 灭菌时间必须由全部药液温度直正达到所要求的温度时算起，在开始升温时，要求预热 1530 分钟。D 灭菌完毕后，停止加热，一般必须使压力表所指示的压力
5、逐渐下降到零，才能放出锅内蒸气，使锅内压力与大气压相等后，稍稍打开灭菌锅待 1015 分钟，再全部打开。这样可避免内外压力差太大而使物品冲出锅外和使玻璃瓶炸裂。这点必须注意，以免发生工伤事故。 流通蒸气灭菌和煮沸灭菌法 流通蒸气灭菌是不密闭的容器内，用蒸气灭菌。压力与大气压相等。即 100的蒸气灭菌。低温间歇灭菌法 此法是将待灭菌的制剂或药品，用 6080加热 1 小时，将其中的细菌繁殖体杀死，然后在室温或孵卵箱中放置 24 小时，让其中的芽胞发育成为繁殖体，再二次加热将其消灭为止。加热和放置需连续操作三次以上，至全部芽胞消灭为止。 影响湿热灭菌的因素 A 微生物的种类和数量 B 注射液的性质
6、 C 药物的稳定性 （3）紫外线灭菌法 一般用于灭菌的紫外线波长是 200300nm，灭菌力最强的是波长为 254nm4 的紫外线。紫外线进行直线传播，其强度与距离平方成比例地减弱，并可被不同的表面反射。其穿透作用微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水，其中悬浮物或水中盐类增多时，则穿透程度显著下降。所以紫外线广泛作空气灭菌和表面灭菌之用。 （4）过滤除菌法 是使药物溶液通过无菌的特定滤器，除去活的或死的微生物而得到不含微生物的滤液。适于很不耐热的药液的灭菌。 繁殖型细菌很少有小于 1m 者，芽胞大小为 0.5m 或更小些，所以，对于以过筛作用滤过的滤器，例如纤维素酯膜滤器。其孔径大秘须小到足以阻
7、止细胞和芽进入滤孔之内，大约为 0.2m。靠阻留于孔道之内或静电作用的滤器，孔径可稍大于所要滤除的颗粒，但如压力过大或波动，颗粒有被挤过的可能。 近年来广泛采用微孔薄膜作灭菌滤器，膜滤器的性能详见注射剂一章滤器的种类与选择项下，作灭菌过滤一般选用孔径 0.22m 的滤膜。G6 号垂熔玻璃漏斗，其滤孔直径在 2m 以下，可以除去细菌，对药物不吸附，也不影响药液的 pH，常灭菌滤器。此外孔径 0.8-1.8m 的石棉板滤器孔径 1.5-1.7m 的白陶土滤柱，也可作滤过细菌用，但由于它们存在一些缺点，所以实际使用不多。（5）辐射灭菌法 辐射灭菌是应用 射线杀菌的方法。 射线通常可由放射性同位素如
8、Co60产生。辐射灭菌的特点是可不升高的产品的温度 ，特点用于某些不耐热的灭菌，穿透性强， 射线适用于较厚样品的灭菌。 辐射灭菌，设备费用高，某些药品经辐射灭菌后，有可能效力降低，产生毒性物质或发热性物质，且溶液不如固体稳定，同时要注意全防护问题。 （6）微波灭菌法 是指频率在 300 兆赫到 300 千兆赫之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使极性分子转动，由于分子间的摩擦而生热。热是在被加热的物质内产生的，所以加热很均匀，并且升温迅速。同时，由于微波可穿透介质较深，所以在一般情况下，可以作到表里一致地均匀加热。微波所以用于水性注射的灭菌，主要是由于其产生热效应的缘故。 微波灭菌法含菌量高达
9、350 万个大肠杆菌的生理盐水混悬液，密封在 12ml 的安瓿中，经 35 千瓦功率， 2450 兆赫的微波作用 15 秒钟以上，安瓿温度接近 110 左右时，可将细胞细菌全部杀灭。金黄色葡萄球菌与此结果近似，枯草杆菌芽胞，含量为 6 万8万个时，液温必须达到 140，保持 20 秒钟以上。才能彻底杀灭，含 2，000 3，000个青菌胞子的生理盐水混悬液，在 34 千瓦微波功率作用下，液温达到 120以上，经20 25 秒钟，即彻底杀灭。经过微波灭菌后的安痛定、维生素、维生素 C、速尿、庆大霉素、卡那霉素注射液。除维生素 C 的溶液色泽有部分变黄外，其他五种的色泽、pH 和主要成份含量都无明
10、显变化。宇野等还比较了微波灭菌与高蒸气灭菌对 17 种化学药物稳定的影响，认为对高压蒸气灭菌稳定的药物，使用微波灭菌时无变化，而对高压蒸气灭菌不稳定的药物如维生素 C，阿司匹林等用微波灭菌，则比较稳定，其分解程度降低。此法由于存在破损率高，灭菌不完全及劳动保护等问题，还有待进一步研究。 （7）其他灭菌法 高速风灭菌法，应用的风速为 3080m秒，风温度高为 190，由于降低了安瓿周围的滞流层的厚度，使安瓿内液体迅速升温。2ml的安瓿注射液应用此法，能于 3 分外的短时间内升高至 140，对于耐热性高的嗜热脂肪芽胞杆菌，液温度达到 130以上，就呈现显著灭菌效果。与热压蒸气灭菌法比较，不但具不同
11、等以上的灭菌效果，并使注射液变质较少。因此，作者认为高速热风菌法，对于小容量安瓿注射液的灭菌极为不利。 此外还有超音波灭菌法，仅用于疫苗制品。 3.1.2.2 化学灭菌法 本法是指用化学药品直接作用于微生物而将其杀死，同时不应损害制品的质量，常用的方法有： （1）气体灭菌法 制药工业上用于菌的气体，多用环氧乙烷。沸点为10.9，室温下气，在水中溶解度很大，1ml 水中可溶 195ml（20，760mmHg），易穿透塑料，纸板及固体粉末，暴露于空气中环氧乙烷就可从这些物质消散，环氧乙烷对大多数固体呈惰性。环氧乙烷的杀菌作用，由于其为烷化剂的性质，使菌体蛋白的-COOH，-NH 2，-SH，-OH
12、，的 H，被-CH 2-CH2-OH 所换。可用以灭菌塑料容器，对热敏感的固体药物，纸或塑料包装的药物，橡胶制品、注射筒,注射针头，衣着敷料及器械等。但是，一些塑料、皮革及橡胶与环氧乙烷有强亲和力，故需长达 1224 小时通空气驱除。我国曾用环氧乙烷对苄霉素普鲁卡因进行灭菌，效果良好。 环氧乙烷具可燃性，当与空气混合，空气含量达 3.0%（v/v）时即可爆炸。故应用时需用惰性气体二氧化碳或氟利昂稀释。环氧乙烷的吸入毒性较大与氨相近，无氨样的剌激嗅味，损害皮肤及眼粘膜，可产生水泡或结膜炎，故应用时要注意。 用环氧乙烷来菌的程序，大致为将灭菌物品置于灭菌器内后，减压排除空气，预热，环氧乙烷采用混合
13、气，一般用环氧乙烷 12氟利昂 88或用环氧乙烷 10二氧化碳 90，在减下输入混合气，保持一定浓度、湿度、及温度，以过一定时间后，抽真空排除环氧乙烷，然后送入无菌空气完全排除环氧乙烷的浓度为 850900mg/L（3 小时、45）45 mg/L（5 小时，45），相对湿度以4060为宜湿度为 2255。 在药剂工作中，也常利用一些化学药剂的蒸气熏蒸，进行操作室内的灭菌。甲醛溶液加热熏蒸，每立方米空间用 40甲醛溶液 30 m1 室内相对湿度宜高，以增进甲醛气体灭菌效果。甲醛对粘膜有强性激性，灭菌后剩余的甲醛气体可排除或通入氨予以吸收。亦有采用丙二醇作室内空气灭菌者，丙二醇具有不挥发性和无引火
14、性等特点，灭菌用量为1ml/m3，将丙二醇置蒸发器中加热，使蒸气弥漫全室。也有用乳酸蒸气灭菌者用量为 2 ml/m3，杀菌力虽不及甲醛，但对人无害，此外，还有使用三甘醇（Triethyene glyool HO-(CH2)2-O-(Ch2)2-O-(Ch2)2-OH）的，三甘醇是无色粘稠液体，沸点 285 ，溶于水使用方法与丙二醇同，也有报导，过酣酸用于车间的室内菌，效力比相同浓度的甲醛大两倍半，对粘膜，眼部无剌激性，对木制品、金属制品、医疗器械均无影响。 （2）应用化学杀菌剂 在制剂工业上应用化学杀菌剂，其目的在于减少微生物的数目，以控制无菌状况至一定水平。化学杀菌剂并不能杀死芽胞，仅对繁殖
15、体有效。化学杀菌剂的效果，依赖于微生物的种类及数目，物体表面光滑或多孔与否，以及化学杀菌剂的性质。常用的有 0.10.2新洁而来溶液，2左右的酚或煤酚皂溶液 75酒精等。由于化学杀菌剂常施用于物体表面，也要注意其浓度不要过高，以防其化学腐蚀作用。3.1.2.3 F 与 Fo 值在灭菌中的意义与作用 简介灭菌温度多系测量灭菌器内的温度不是灭菌物体内的温度，同时无菌检验方法也在局限性。在检品存在微量的微生物时，往往难以用现行的无菌检验法检出。因此，人们对认识到对灭菌方法的可靠性进行验证是很必要的。F（或F）值可作用验证灭菌可靠性的参数。 （1）微生物致死间曲线与 D 值人们对微生物死亡的动力学研究
16、表明，其死亡速度属一级过程。为原始微生物数，Nt 为残存的微生物 t 时残存的微生物。残存数的对数时间作图，得一条直线，直线的斜率K2.303，K 为速度常数，单位为时间。为了方便起见，引用 D，并定义 D 为一定温度下杀死被灭菌物品中微生物 99所需时间。 因此，D 也可定义为降低微生物一个十位数或一个对数值（如 log100 降低到 log10）所需的时间。D 值因微生物的种类、环境、灭菌温度不同而各异（表 1）。 （2）Z 值一旦在不同温度下对特定的微生物的在特定介质或环境中求得 D 值后，就可用 logD 值对温度作图，在一定温度范围内，logD 与 T 呈直线关系，直线的斜率logD
17、 2logD 1T 2T 1。 由于此斜率为负值，为避免引入负数，而提出 Z 值的概念，ZTT 1logD 2logD 1，故定义 Z 值为降低一个 logD 值需的温度数，如单位为度，也可以认为 Z 值是降低微生物数90所需要的温度数。表 2 是一些药物溶液的 Z 值 表 1 不同灭菌法不同微生物的 D 值 灭菌方法 微生物 温度 介质或样品 D 值（min）蒸气灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 105 5葡萄糖水溶液 87.8蒸气灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 121 5葡萄糖水溶液 2.4蒸气灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 121 注射用水 3.0蒸气灭菌 产芽胞梭状芽孢杆菌 105 5葡萄糖水溶液 1.3干热灭
18、菌 枯草芽胞杆菌 135 纸 16.6红外线灭菌 枯草芽胞杆菌 160 玻璃板 18 秒表 2 不同溶液以嗜热脂肪芽孢村菌测定 Z 值 溶液 Z 值5葡萄糖水溶液 103注射用水 845葡萄糖乳酸盐林格氏溶液 113PH7 磷酸缓冲液 76（3）F 值与 Fo 值 F 值 F 值的数学表达或可表示如下： t 是测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为 0.51.0 或更小，T 是每个t 测量被灭菌的温度，To 是参比温度。 按此表达式，F 为在一定温度（T），给 Z 值所产生的灭菌效力与参比温度（To）给定Z 值所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（equivalent time）以分为单位。例如干热
19、灭菌的参比温度用 170，消毁大肠杆菌内毒素（endotoxin of E.Coli）的 Z 值为 54，则采用 250干热灭菌消毁上述内毒素的 F 值为 750分。 根据式（11），若 Nt 确定为灭菌效果。同时 D2.303K，故也可将在一定温度（T）下杀死容器中全部微手物所需的时间称为 F 值，它等于 D 值与微生物数降低值的乘积，F 值的意义就更明确了。 FDT（log100log10 6 ） Fo 值为一定灭菌温度（T）Z 值为 121，并假设特别耐湿热的微生物指示剂（嗜热脂肪芽胞杆菌）的 Z 值为 10，则 显然，Fo 值为一定灭菌温度（T）Z 值为 10 所产生的灭菌效果力相同时
20、所相当的时间（分）。也就是说 Fo 是将各种灭菌温度使微生物的致死力转换为灭菌物品完全暴露于121使微生物致死效力。 灭菌过程中，只需记录被来菌物的温度与时间，就可算出 Fo，假设如下数据，t 取0.5 分。 时间(min) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0温度() 100 102 104 106 108 110 115 114 115并假设 4.0min 以后，维持 11530 min 不变，则 Fo 还可以看作 P（2）值与微生物的对数降低值的乘积。 FoD 121（logNologNt） 同样，Nt 为灭菌后希望达到微生物残存数，一般取 10-6如将含有
21、 200 个嗜热脂肪芽胞杆菌的 5葡萄糖水溶液以 121热压灭菌时杀死容器中全部微生物所需要的时间。 Fo 值的计算对于验证灭菌效果极为有用，当产品以 121湿热灭菌时，灭菌器内的温度虽能迅速升到 121，而被菌物品内部则不然，通过由于包装材料性能及其他因素影响而使。升温度各异，而 Fo 将随着产品温度（T）变化而呈指数的变化。故温度即使很小的差别（如 0.1-1）,将对 Fo 值产生显著的影响。同时要求测定灭菌物品内的实际温度，故用 Fo 来监测难灭菌效果肯有重要的意义。由于 Fo 是将不同灭菌温度折算到相当于 121湿热灭菌时的效力，故 Fo 值可作为灭菌过程的比较参数。 为了使 Fo 测
22、定准确，先应选择灵敏度高，重现性好，精密度为 0.1 的热电偶，并对热电偶进行校验。灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部，经灭菌器通向柜外的湿度记录仪，有些灭菌记录仪（digistrip recolder）附有 Fo 计算器，在灭菌过程中和灭菌后，自动显示 Fo 值。 另外，还应考虑一些其他因素对 Fo 值的影响，有人对溶液粘度，容器充填量及容器在灭菌器内的数量与排布进行了研究。结果发现对 Fo 均有影响，而以后者影响最大。故要注意灭菌器内各层、四角、中间位置热分布是否均匀，并进行实际测定，作出合理排布，以便测得 Fo 值更可靠。 为了确保灭菌效果，还应注意两个问题，根据 FoD121（lo
23、gNologNt），若 N 越大，即被灭菌物中微生物越多，则灭菌时间越长，故生产过程中应尽量减少微生物的污染，应采取各种措施使每个容器的含菌数控制在 10 以下（即（log101）。其次计算 Fo 时，应适当考虑增加安全因素，一般增加 5，如规定 Fo 为 8 分，则实际操作应控制 Fo12 分为好。 3.1.3 无菌操作法 （后续课“药事与管理法规”中有详述）无菌操作法，是整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。某些药品加热灭菌后发生变质、变色或降低含量者可采用无菌操作法制备。此种无菌操作，不仅用于注射剂而且对其它的如滴眼剂、海棉剂等用于粘膜和创伤的制剂也均适用。无菌操作室或无菌操作所用
24、的一切用具、材料以及环境，均须应用面所述灭菌法灭菌，操作须在无菌操作室或无操作柜内进行。 （1）无菌操作的空气灭菌可应用甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具体用法不再赘述。药厂大型无菌操作，常用甲醛溶液加热熏蒸进行空气灭菌。将甲醛溶液放入瓶内，逐渐被吸收蒸气夹层加热锅中，甲醛溶液被加热，甲醛蒸气经气出口送入总进风道，由鼓风机吹入无菌操作室，连续 3 小时后，一般即可将鼓风机关闭。室温应保持 25以上，以免室温过低甲醛蒸氯了聚合而附着于冷表面，湿度应保持 60以上，密闭熏蒸 1224 小时以后，再将 25氨水加热（每 m3用 810ml），从总风道送入氨气约 15 分钟，以吸收甲醛蒸气，然后开启总
25、出口排风，并通入经处理过的无菌空气直到室内无臭气为止。 除用上述方法定期进行较彻底的灭菌外，还要对室内的空间、用具（桌椅等）、地面、墙壁等，用 3酚溶液、2煤酚皂溶液、0.2%新洁而或 75酒精喷洒或擦试。其它用具尽量用热压灭菌法或干热灭菌法灭菌。每天工作前开启外线一小时，中午休息时间也要开 121 小时。 （2）无菌操作 操作人员进入操作之前要洗澡并换上已经灭菌的工作服和清洁的鞋子，不使头发、内衣等露出来，以免造成污染机会。安瓿要15018023 小时干热灭菌。橡皮塞要以 1211 小时热压灭菌。有关器具、机器都要经过灭菌。用无菌操作法制备的注射剂， 大多要加入抑制。 小量无菌制剂的制备，也
26、可在无菌操作柜中进行。无菌操作柜分小型无菌操作与联合无菌无操作两种小型无菌操作柜又称单人无菌柜。式样有单面式与双面式两种。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下装木板，挖二圆孔，孔内密接橡皮手套或袖套。药品及用具等，由侧门送入柜内后关闭。操作时可完全与外界空气隔绝。柜内空气的灭菌，可在柜中央上方装一小型紫外线灯，使用前 1 小时启灯灭菌，或用药液（如 3酚溶液）喷雾灭菌。联合无菌操作柜是由几个小型操作柜联合制成，以使原料的精制，传递分装及成品暂时存放等工作全部在柜内进行。近年来，采用层流洁净工作台作无菌操作，使用方便，效果可靠。 3.1.4 无菌检查法 药剂或药品经灭菌或无菌操作法处理后，需经无菌检验证实已无微生物生存，方能作用。 法定的无菌检查法，包括有试管接种法和薄膜过滤法，其具体操作方法以及在一些特殊情况下的变动，可详见中国药典附录中的无菌检查法。薄膜过滤用于无菌检查的突出优点，在于可滤过较大量的样品可滤除抑菌性物质，滤过后的薄膜，即可直接接种于培养基管中，或直接用显微镜观察，故此法灵敏度高，不易产生假阴性结果，检测次数减少，节省培养基，操作比较简单。
