1、肿瘤学专业优秀论文 RNA 干扰对结肠癌 HT-29 细胞 PIDD 蛋白表达及药物敏感性影响的研究关键词：结肠癌 HT-29 细胞 细胞凋亡 RNA 干扰 PIDD 蛋白 药物敏感性摘要：一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑
2、制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞DNA 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kD
3、a，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的 C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的 NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解
4、IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同
5、时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。
6、MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它3 种 siRNA 相比较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 48h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达。空白对照和
7、对阴性照给予 5-Fu 处理后 PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29 细胞 NF-KB的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染组的凋亡率大大
8、高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低HT-29 细胞中 PIDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。正文内容一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子
9、 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear
10、-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DNA损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的 C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(recep
11、tor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的
12、抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行
13、后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。 三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它 3 种 siRNA相比
14、较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 48h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中 PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达。空白对照和对阴性照给予 5-Fu 处理后PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD 在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(
15、Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29 细胞 NF-KB 的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染组的凋亡率大大高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低 HT-29 细胞中 PIDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细
16、胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从
17、而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DN
18、A 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF
19、-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用
20、RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞
21、分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。 三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它 3 种 siRNA相比较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 48h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质
22、中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中 PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达。空白对照和对阴性照给予 5-Fu 处理后PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD 在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29 细胞 NF-KB 的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍
23、为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染组的凋亡率大大高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低 HT-29 细胞中 PIDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性
24、降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即
25、，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DNA 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研
26、究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过
27、程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜
28、检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。 三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察
29、，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它 3 种 siRNA相比较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 48h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中 PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达。空白对照和对阴性照给予 5-Fu 处理后PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD
30、 在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29 细胞 NF-KB 的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染组的凋亡率大大高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低 HT-29 细胞中 P
31、IDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在
32、肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始
33、动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DNA 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxi
34、c stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完
35、善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核
36、蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。 三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它 3 种 siRNA相比较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 4
37、8h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中 PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达。空白对照和对阴性照给予 5-Fu 处理后PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD 在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29
38、细胞 NF-KB 的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染组的凋亡率大大高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低 HT-29 细胞中 PIDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药
39、物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-k
40、B 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DNA 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约
41、100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆
42、，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA
43、四对，同时设计一套序列相同的阴性对照。将 siRNA 分别转染 HT-29 细胞，转染 24h、48h、72h 用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白，并用 Western blot 法检测转染效果。选择转染效果最佳的 siRNA 作为转染组，进行后继实验。 2.分别用 5-Fu 处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞，抽提处理前后共 6 组细胞的胞浆及胞核蛋白，Westem blotting 检测 PIDD 表达。3 组细胞处理前后 NF-kB 活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及流式细胞仪(FCM
44、)检测。MTT 法检测 3 组细胞对 5-Fu 的敏感性。 三、主要结果 1.PIDD siRNA 的转染效率荧光显微镜观察，各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于 90，Westem blotting 检测，可以发现与其它 3 种 siRNA相比较，PIDD-360 的转染效率有升高的趋势，但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系，即：转染 48h 后能检测出抑制效应，72-96h 左右达到最高峰。 2.Westem blotting 结果提示转染组的细胞核和细胞质中，PIDD 的表达均明显低于对照组；在空白组对照组和阴性对照组细胞中 PIDD 主要分布于细胞质，细胞核少见表达
45、。空白对照和对阴性照给予 5-Fu 处理后PIDD 分布发生了明显的变化，迁移至细胞核中；转染组 5-Fu 处理后 PIDD 在胞浆和胞核中的表达仍未升高。 3.MTT 结果显示转染组的药物敏感性明显降低，与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(Plt;0.05)。 4.EMSA 检测细胞核蛋白 NF-kB 的活性未用 5-Fu 处理的 3 组 HT-29 细胞 NF-KB 的表达均为阴性，在用 5-Fu 刺激后，空白对照组及阴性对照组 NF-1(B 的活性明显增高，而转染组则仍为阴性。 5.FCM 分析三组细胞的凋亡率接近，无统计学差异(Pgt;0.05)，但给予 5-Fu 处理后，则转染
46、组的凋亡率大大高于其他两组，差异显著(Plt;0.05)。 四、结论 1.特异性 siRNA 可减低 HT-29 细胞中 PIDD-C 的表达，其抑制效应较为明显，且存在一定的时效关系。 2.PIDD-C 形成的胞核复合体能有效激活 HT-29 细胞中无活性的 NF-kB，启动存活基因的转录，从而诱导了抗凋亡途径的激活，使 HT-29 细胞对于 5-Fu 的药物敏感性下降。 3.干扰 HT-29 细胞 PIDD-C 的表达能有效降低胞核 PIDD 复合体的形成，使 NF-kB 活性降低，从而抑制抗凋亡途径，HT-29 细胞对 5-Fu 的药物敏感性升高。一、背景与目的 在肿瘤发生发展过程中，核
47、转录因子 KB(NF-KB)的活化起着重要作用。已知 NF-KB 活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切，而在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为 NF-KB 活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。 在过去的研究中，已揭示了细胞表面受体诱导 NF-kB 活化的过程：在未受到刺激的细胞中，NF-kB 与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后，细胞浆内的一系列激酶活化从而引起 NF-kB 的活化，随即，活化的 NF-kB 进入细胞核，激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明，NF-kB 活化的“胞核至胞浆(nuc
48、lear-to-plasmic)”通路也许更为重要，因为大多数化疗药物可直接引起 DNA 损伤，其诱导 NF-kB 活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在细胞 DNA 损伤中介导了 NF-KB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子，主要存在于胞浆内，分子量约 100kDa，在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C 末端 PIDD-C 和富含亮氨酸重复序列的 N 末端 PIDD-N。目前的研究发现 PIDD-C 可进入胞核内与 NEMO(NF-KB essential modulator)和 RIP1(
49、receptor-interactingprotein1)形成“胞核 PIDD 复合体” ，在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)结合，促进其发生磷酸化和泛素化，活化后的 NEMO 从胞核进入胞浆，降解 IkB， NF-kB 即被活化进入胞核，启动存活基因的转录，从而表现为抗凋亡效应。 鉴于 PIDD 在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用，而既往有关研究资料又缺乏对 PIDD 与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨，本研究重点讨论 PIDD 所介导的抗凋亡途径与 HT-29 细胞药物敏感性变化的关系，初步明确 PIDD 对于结肠癌细胞药物敏感性的作用，以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。 二、方法 1.PIDD siRNA 的构建、转染及检测根据人 PIDD 的 mRNA，应用 RNAi 设计软件，进行全基因组扫描和序列同源性分析，设计针对 Genbank 中 PIDD 的特异 siRNA 四对，同时设计一套序列相同
