1、1婴幼儿配方乳粉核苷酸的测定编制说明国家乳制品质量监督检验中心背景：核苷酸是构成核酸的成分，是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸 3 种分子连接而成。核苷酸在人体内广泛分布，具有多种生物学功能：核苷酸是构成核酸的基本单位，这是其最主要功能。参与人体的能量代谢和生理调节。促进抗体形成、增强免疫功能。组成辅酶的作用。一些临床上的研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉，可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。由于核苷酸对婴幼儿的生长发育具有明显作用，近几年来，婴幼儿乳粉生产企业在配方中作为强化成分添加的一定量的核苷酸，并作为卖点在广告宣传中作为重点大力宣传。目前婴幼儿配方奶粉中主要添加的核苷酸主要有
2、5 种：胞嘧啶核苷酸（cytidine,CMP）；尿嘧啶核苷酸（uridine,UMP）；腺嘌呤核苷酸（adenosine,AMP）；鸟嘌呤核苷酸（guanosine,GMP）；次黄嘌呤核苷酸（inosine,IMP）。一般在配方中以 3-4 种核苷酸混合后加入配方粉中。在现行的国家相应标准中未对核苷酸含量进行规定，其检测方法标准也未建立。该成分的含量要求都是通过企业标准在质检部门备案后的企业标准作出的规定。由于在婴幼儿配方食品中使用核苷酸的情况国内外都非常普遍，在市场销售的国外独资企业、进口及国内生产婴幼儿配方粉的大中型企业都在其婴幼儿配方乳粉中加入了核苷酸。虽然核苷酸是婴儿的重要营养素，对
3、婴儿的生长发育有重要的作用但有一定的含量范围，过低起不到应有的营养作用，过高则有可能对婴幼儿的正常生长发育产生不利影响。所以对产品中核苷酸的质量监控极为重要，这就需要相应的检测技术支持。根据目前报道，核苷酸检测方法主要有微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法测定核苷酸较适于对象婴幼儿配方乳粉基质复杂的样品。本研究就是在收集有关资料的基础上，结合乳制品样品的特点，选择离子对反相色谱法进行研究，建立高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的简便、准确的检验方法。一、任务来源、起草单位和主要起草人任务来源：全国乳制品标准化技术委员会任务编号：本标准起草单位：国家乳制品质量监督检验中心、
4、南京同凯兆业生物技术有限责任公司本标准参加单位：上海英特儿营养乳品有限公司、美赞臣营养品（中国）有限公司、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司主要起草人：二、制定标准的必要性和意义1.维护消费者健康的需要核苷酸是构成核酸的成分,牛奶中一般不含有核苷酸，作为添加剂添加的核苷酸目前在乳制品中主要用于婴幼儿配方奶粉中。核苷酸的主要生理功能是广2泛参与人体的能量代谢、蛋白质合成,具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能的作用。对婴幼儿来说可促进神经细胞的生长发育,是与“神经生长因子”有关或者可以作为神经生长物质利用的营养成分；促进铁质吸收及影响脂质代谢,改变肠道菌丛及提供肠道黏膜完
5、整所需的营养,达到提升免疫功能的效果；一些临床上的研究发现,添加核苷酸的婴儿配方奶粉,可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。但人体对核苷酸的需求是有一定限度的，并非越多越好，必须对其用量进行控制。由于核苷酸价格较高，个别企业添加核苷酸时为降低成本不按配方足量添加甚至不添加，有些企业因工艺过程把握不好造成核苷酸成分损失，而使得核苷酸含量不足，给消费者利益造成损失。所以为了维护消费者利益，必须尽快建立适用于乳制品的检测标准。2.国家政府部门食品安全监管的需要我国自实施食品质量安全市场准入制度以来，对规范食品质量安全生产、保护广大消费者的利益等起到了极为重要的作用。其中食品生产许可证审查细则就是
6、审查生产企业是否符合要求的法规性文件，也是企业必须达到的最低要求。在许可证审查中，添加核苷酸的产品必须在企业标准中进行规定，并发证检验合格后方能达到要求。但对出厂产品质量是否达到标准要求，在政府监管部门实施各类监督中就必须依据相应的标准方法进行检测，所以其产品质量的监督必须有相应的技术标准支持，否则无法有效监管。由此可看出，制订此检测方法标准的重要性与紧迫性。3.完善国家标准的需要由于核苷酸在婴幼儿食品中使用是近几年来的事情，在我国现行的标准中尚缺失针对婴幼儿食品中核苷酸的检测方法标准，这也是完善食品检测方法国家标准的需要。三、起草过程1.前期工作核苷酸在婴幼儿配方乳粉中使用始于 5 年前，当
7、时根据个别企业的要求，我们于 2003 年开始开展了反相高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸方法的研究，并于当年将研究成果发表于中国食品添加剂。在以后的 5 年中，婴幼儿配方乳粉生产使用核苷酸的企业数量剧增，目前有 90%以上的企业都作为营养成分之一添加核苷酸，作为检测机构急需建立才完善的检测方法并尽快申报国家标准已成为当务之急。基于这种情况，我们又在 2006 年专门组织技术人员成立研究小组对原来的检测方法研究进行了分析，从而找出原方法的缺陷，同时通过各种途径收集相关技术资料，制定了进一步开展研究的技术路线。因原方法中采用的是缓冲盐作为流动相，且 5 个组分须采用不同的流动相分两次进行测定，其方
8、法较为繁琐，若制定为国家标准明显不符合要求。为此，我们通过论证决定采用离子对色谱法一次同时测定 5 个组分的技术路线展开研究，并于 2006 年底初步完成了乳制品中核苷酸检测技术的研究工作。自 2007 年起，为进一步完善该技术，我们又与南京工业大学国家生化工程技术研究中心下属专业生产核苷酸的产业基地南京同凯兆业生物技术有限责任公司合作，利用他们的技术优势，共同对该检测技术进一步实验研究，通过大量实验建立了高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的方法。为将该方法能及时上升为国家标准，解决乳制品中核苷酸的检测及在婴幼儿配方乳粉等发证检验有据可依等问题，我们通过全国乳品标准化中心向国家标委会提出立项的申
9、请，并于 2007 年批准。3随后我们共同组织了标准起草小组，按照国家标准制定的要求对方法的适用范围、采用的标准、验证方法、准确性、精密度等方面进行了分析和确认，并于2007 年底基本完成了实验室验证工作。通过验证后认为此方法操作简单、准确、快速，基本符合制定国家标准的条件。2.实验室间验证工作2008 年 6 月，全国乳品标准化中心在青岛组织召开了乳品系列标准的制修订工作研讨会，我们提交了由国家乳制品质量监督检验中心与南京同凯兆业生物技术有限责任公司共同起草的标准讨论稿，并对该标准进行了详细的介绍。会上一致通过了该标准讨论稿并同意进行方法验证。根据会议精神，我们邀请了通过 CNAS 认可的实
10、验室美赞臣（广州）有限公司、上海英特尔营养乳品有限公司、内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司等单位与我中心共同进行了实验室间的方法验证工作。通过统计分析各实验室提交的检测数据，验证了该方法的精密度等。参加验证的实验室一致认为：该方法用于测定以婴幼儿配方乳粉类产品为主的样品中核苷酸的含量，具有测定结果准确可靠，操作简单、快速等特点。四、制定标准的原则和依据。目前报道的检测方法主要有微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等，对于核苷酸的仪器分析报道较多，多用 ODS 反相色谱柱，通常采用离子对反相色谱法，但都不适合乳品中核苷酸的测定。本研究就是在收集有关资料的基础上，结合乳制品样品的特点，选择离子对反相
11、色谱法进行研究，建立了高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的简便、准确的检验方法。经实验验证认为该方法的准确性、重现性、检出限等完全能满足婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸含量测定的要求。五、标准主要条款的说明1.标准名称和适用范围本标准的名称为婴幼儿配方食品和乳粉核苷酸的测定，适用于婴幼儿配方食品、乳粉中 5 种核苷酸的测定（胞嘧啶核苷酸 CMP、尿嘧啶核苷酸 UMP、腺嘌呤核苷酸 AMP、鸟嘌呤核苷酸 GMP、次黄嘌呤核苷酸 IMP）。2.样品处理方法的研究样品的处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来。为此，我们将样品用水溶解，通过超声波振荡后采用 3 种样品处理
12、方式来沉淀蛋白质：10%乙酸、调 pH 值及 0.33mol/L 的高氯酸。10%乙酸沉淀蛋白和高氯酸沉淀蛋白质的方法是，将充分振荡溶解的样品转入 50mL 容量瓶中，加入 5mL10%乙酸或 0.33mol/L 的高氯酸溶液，定容，充分混匀后用滤纸过滤；调 pH 法沉淀蛋白质的方法是，先用稀盐酸溶液将充分振荡溶解的样品溶液的 pH 调至 1.7，静止 1min 后再用氢氧化钠调 pH 到 4.5，转入 50ml 容量瓶中定容，混匀，用滤纸过滤。上述滤液通过 0.45m 的滤膜过滤后上机测定。通过对测定色谱图进行分析后发现，上述 3 种处理方式对色谱图中杂质峰的数量和色谱峰形及分离度都有有一定
13、的影响：调 pH 沉淀蛋白质的试液杂质峰要多于用乙酸沉淀蛋白质的方法；使用高氯酸沉淀蛋白和乙酸沉淀蛋白效果相近，但用乙酸沉淀时色谱峰形最好，而且方便。根据上述处理样品方法的比较，确定采用 10%乙酸沉淀蛋白质的样品处理方法。4.色谱柱及条件的选择4.1 色谱柱的选择4色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。由于核苷酸为离子型化合物，采用离子对色谱进行各组分的分离可能会得到理想的结果。在色谱柱的选择上，我们先后采用了 AichromBond-AQC18 柱、SUPELCOSILLC-18-TC18 柱和氨基柱 waters 三种色谱柱进行实验。结果发现：使用氨基柱时，GMP
14、和 IMP 完全重叠在一起，没有分开，所有组分在 10min 左右全部流出；使用 AichromBond-AQC18 柱时，由于流动相的细微变化，其中GMP 和 IMP 有时重叠在一起，有时分离度较差，较难分离；而 SUPELCOSILLC-18-T 可以使 5 种核苷酸都得到较好的分离。SUPELCOSILLC-18-T 柱添料的硅表面经过特殊的处理，与普通的 C18 柱相比，它可以减少硅烷醇和核苷酸之间的相互作用，提高分析的灵敏度，因此我们选用 SUPELCOSILLC-18-T 柱进行测定。4.2 流动相的选择我们主要对流动相进行了优化，即离子对试剂的浓度、流动相 pH 值和甲醇浓度进行
15、优化。4.2.1 离子对试剂的浓度我们选用离子对试剂四丁基硫酸氢铵的浓度分别为1.30mmol/L、1.40mmol/L、1.50mmol/L、1.70mmol/L、1.75mmol/L 和2.0mmol/L，由试验结果可以看出离子对试剂浓度变化对核苷酸的出峰顺序、分离效果及峰形影响很大：当四丁基硫酸氢铵浓度为 1.40mmol/L 时，分离效果最好，基线分离，峰形对称，且样品中的核苷酸与杂质峰完全分开，色谱峰的顺序为 CMP、AMP、UMP、GMP 和 IMP，因此我们选用离子对试剂的浓度为1.40mmol/L。4.2.2 流动相 pH 值的选择考虑到核苷酸的水溶液在酸性环境中比较稳定，选择
16、调节流动相的 pH 值为酸性。对 pH 值在 4.56.0 之间进行实验，经过采用不同 pH 值的试验证明：pH为 5.0 时，核苷酸的 5 个色谱峰能够完全分开，灵敏度比较高，最终确定选择pH 为 5.0。实验表明 pH 值对色谱峰的分离有很大的影响，因此调流动相 pH 时，一定要精确。4.2.3 甲醇体积分数在确定离子对试剂的浓度（1.40mmol/L）和流动相的 pH 值（5.0）后，又对含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：0、100：1、100：2.5、100：4、100：5 和 100：10 的流动相进行实验。实验表明：加入甲醇的体积对 5 个组分峰的保留时间影响较大
17、，而且对 5 个组分峰影响的程度不一样，并直接影响出峰顺序及分离度。结果表明含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为 100：4 的流动相效果更好。经过实验，最终决定采用含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为 100：4 的溶液作为流动相。5图 1 五种标样色谱图6图 2 样品与样品加标样色谱图5.标准曲线的绘制将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列，分别用不同浓度的标准溶液进样，以浓度为横坐标，峰高均值为纵坐标，绘制标准工作曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数，可见在一定浓度范围内浓度与峰高间呈正相关，相关性好，可用于外标法进行定量测定。见下表 1：表 1 核苷酸标准系列浓度
18、及峰高间回归方程与相关系数6分析结果的计算液相色谱法测定样品中核苷酸含量采用在一定浓度的范围内符合比尔定律的原理，通过绘制标准回归曲线的方式，查出样品待测液中核苷酸的浓度，从7而计算出样品中的含量。对于高含量的样品，可通过取样量等方法将核苷酸的浓度控制在适当的范围，保证测定液中核苷酸的浓度在线性范围内。7线性范围为了确定本标准适用的线性区间，设计实验测定方法线性范围。在允许的范围内，核苷酸各组分标准系列浓度分别为：CMP 0-120g/mL、AMP 0-100g/mL、UMP 0-150g/Ml、GMP 0-50g/mL、IMP 0-50g/mL，经验证符合比尔定律。在操作上直接吸取标准工作液
19、上机，标准系列浓度测定结果及线性回归方程及相关系数见表 1。8最低检测限根据 GB/T5009.1-2003，中 A2.1 色谱法的计算方法，计算检出限：式中：b标准曲线回归方程中的斜率，响应值/g 或响应值/ng；s为仪器噪音的 3 倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。结果：样品 CMP 检出限为 1.12mg/kg。样品 UMP 检出限为 1.60mg/kg。样品 GMP 检出限为 1.62mg/kg。样品 IMP 检出限为 2.24mg/kg。样品 AMP 检出限为 1.33mg/kg。9准确度为了确定本方法的准确度,根据 GB/T5009.1-2003，我们选用 3 个样品为试验材料，加
20、入核苷酸混合标准溶液，按照标准讨论稿的方法进行回收率测定，每个样品进行四次重复，测定结果见表 2：表 2 回收率试验结果810精密度国家乳制品质量监督检验中心实验室内精度表如下：9方法验证：由我中心统一制备样品，同时发送到 4 个参加方法验证的实验室进行验证。其中 3 个实验室对每个样品共测定 8 次，1 个实验室对每个样品测定 6 次，结果见表 3：国家乳制品质量监督检验中心精密度测试表10美赞臣（广州）有限公司实验室内精密度测试表蒙牛乳品公司实验室内精密度测试表上海英特儿营养乳品有限公司精密度测试表11附 1：精密度计算依据 GBT6379.2-2004测量方法与结果的准确度第 2 部分确
21、定标准测量方法重复性与再现性的基本方法计算重现性标准差与再现性标准差。表 3 原始记录：核苷酸测定结果（mg/100g）12表 4 样品核苷酸含量的单元平均值（mg/100g）项目 CMP UMP GMP IMP AMP表 5 样品核苷酸含量的标准差10.1 一致性和离群值的检查CMP 的柯克伦检验：p=4,n=8,柯克伦检验 1%临界值为 0.613，5%临界值为 0.536对水平 1，实验室 2 的 s 最大：S2=0.6354;检验统计量值=0.468对水平 2，实验室 2 的 s 最大：S2=0.2322;检验统计量值=0.503对水平 3，实验室 2 的 s 最大：S2=0.4270
22、 检验统计量值=0.753对于 CMP 水平 3 时,实验室 2 的这个单元是离群值。UMP 的柯克伦检验：p=4,n=8,柯克伦检验 1%临界值为 0.613，5%临界值为 0.536对水平 1，实验室 4 的 s 最大：S2=0.1294;检验统计量值=0.541对水平 2，实验室 4 的 s 最大：S2=0.1634;检验统计量值=0.529对水平 3，实验室 2 的 s 最大：S2=1.1343;检验统计量值=0.847对于 UMP,水平 1 时，实验室 4 的这个单元是岐离值；对 水 平 3， 实 验 室 2 的 这 个 单 元 是 离 群 值 。 岐 离 值 予 以 保 留 ， 参
23、 与 后 续计 算 。GMP 的柯克伦检验：p=4,n=8,柯克伦检验 1%临界值为 0.613，5%临界值为 0.536对水平 1，实验室 4 的 s 最大：S2=0.1093;检验统计量值=0.430对水平 2，实验室 2 的 s 最大：S2=0.2422;检验统计量值=0.491对水平 3，实验室 2 的 s 最大：S2=0.2366;检验统计量值=0.536对于 GMP,各水平没有岐离值和离群值。IMP 的柯克伦检验：p=4,n=8,柯克伦检验 1%临界值为 0.613，5%临界值为 0.536对水平 1，实验室 2 的 s 最大：S2=0.0297;检验统计量值=0.43513对水平
24、 2，实验室 2 的 s 最大：S2=0.1510;检验统计量值=0.539对水平 3，实验室 1 的 s 最大：S2=0.0038;检验统计量值=0.352对 于 IMP,水 平 2， 实 验 室 2 的 这 个 单 元 是 岐 离 值 ， 岐 离 值 予 以 保 留 ， 参 与 后 续 计算 。AMP 的柯克伦检验：p=4,n=8,柯克伦检验 1%临界值为 0.613，5%临界值为 0.536对水平 1，实验室 4 的 s 最大：S2=0.1776;检验统计量值=0.490对水平 2，实验室 4 的 s 最大：S2=0.1301;检验统计量值=0.357对水平 3，实验室 4 的 s 最大
25、：S2=0.1245;检验统计量值=0.432对于 AMP,各水平没有岐离值和离群值。将格拉布斯检验应用于单元平均值表 6 对单元平均值的格拉布斯检验对单元平均值进行格拉布斯检验，CMP、GMP、IMP 均有离群值，结合柯克伦检验和进一步调查，予以剔除。10.2mj,srj 和 sRj 的计算根 据 GB/T6379.2-2004 中 7.4.中 所 定 义 的 总 平 均 值 和 方 差 的 计 算 ， 结 果 见 表7：表 7 核苷酸的 mj srj sRj 计算值10.3 精密度与 m 的关系1410.4 结论测量方法精密度（以 mg/100g 表示）可引述如下：依据 GB/T20001.4-2001 标准编写规则-化学分析法中附录 D 计算重现性限与再现性限：项目 CMP UMP GMP IMP AMP重复性限r=2.8Sr r=0.28m+0.3680.220 0.5590.303 0.545再现性限R=2.8SR R=0.042m1.47 R=0.241m1.42 0.935 0.413 0.675六、实施标准的建议标准批准、发布后，由全国乳制品标准化技术委员会组织、国家乳制品质量监督检验中心共同举办标准宣贯会，讲解分析方法的技术要领和关键步骤。
