1、人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨 (1广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2广东省计划生育研究所，广东广州510600) 摘要：目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53.33、73.33、86.67。联合消化组较胰酶组培养成功高(P0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质
2、细胞贴壁、生长状况无明显差异(P0.05)。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间，具有降低培养成本的优点。 关键词：子宫内膜；腺上皮细胞；间质细胞；细胞离体培养 中图分类号：R329.2 人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，是卵巢激素作用的靶组织，在生殖生理的研究中占有重要的地位。现代妇产科学向细胞、亚细胞及分子水平发展，子宫内膜细胞体外培养为研究细胞生长、分化和代谢以及激素作用机制提供一个理想的实验模型，并且可以避开用人体实验进行研究所带来的伦理学问题。而原代培养细胞由于刚离开机体，因此能较好地
3、反映体内细胞的生物学特性，故人离体子宫在位内膜原代培养已成为体外研究的一个重要方法。我们参考文献报道的两种消化酶，即胰酶和胶原酶，并将二者联合应用于分离消化法，对子宫内膜细胞进行了体外培养方法比较，以期得到更为理想的子宫内膜的培养方法。 1资料与方法 11纳入标准 月经干净后37d；月经周期规则；年龄2045岁；术前3个月内未用过激素治疗；无宫内节育器；无内科合并症。 12标本采集 人体正常离体子宫内膜取自2007年25月在本院行妇科手术患者，45例标本均在无菌条件下获得。 所获标本立即置入4、不含钙、镁的无菌Hanks平衡液(DHBSS)中，30min内低温转移至实验室进行培养。全部标本均留
4、部分组织用10福尔马林液固定后作组织学检查。组织学检查未发现病理学改变，其组织学分期均为增生期。将所取标本随机分为3组，每组为15例，分别采用胰酶、胶原酶、胰酶和胶原酶联合消化的方法进行体外培养。3组患者年龄无明显差异(p=0.880.05)。 13材料与仪器 131生长培养液由DMEMF12培养基+15标准胎牛血清+100U/ml青霉素链霉素液配制而成。DMEM/F12培养基、标准胎牛血清、青链霉素液、DHBSS购自广州威佳公司，为GIBCO公司干粉配制。 132细胞消化液胰酶、胶原酶I购自广州威佳科技公司。取胰酶0.25g用灭菌去离子水100m1溶解，配制成终浓度为0.25的消化液，过滤分
5、装，-20保存；取胶原酶I100mg加入灭菌去离子水100ml充分溶解，配制成终浓度为0.1的消化液，过滤分装，-20保存。 133仪器CO2恒温细胞培养箱，25cm2底面积的培养瓶，倒置相差显微镜，台式离心机，微量可调移液器等。 14原代培养方法 参照Ryan、Overton等的方法并作改进： 141胰蛋自酶消化法将所获组织用DHBSS溶液洗涤3次，剪成约0.51.0mm3大小的碎块，置入无菌青霉素小瓶中，注入预加温至37的0.25胰蛋白酶消化液约45m1，混匀后置37温箱中消化。每510分钟用玻璃吸管轻轻吹打细胞，15min后静置片刻，待组织下沉后，吸出2/3上清液转移至10m1玻璃离心管
6、中，加入含有20胎牛血清的培养液终止消化。剩余1/3，再补加新的胰蛋白酶液继续消化。消化时间为2030min，消化后细胞悬液含单个间质细胞及葡萄串状上皮细胞。消化完毕后1000r/min，离心5min，吸除上清液。将沉淀物用DHBSS漂洗2遍后，加入培养液，吹打成均匀的细胞悬液。调整细胞密度为1103/ml，接种于25Cm2的培养瓶中。置于37、5CO2的温箱中培养。以后每隔3d更换培养液1次，换液时注意留1/4原培养液，至单层细胞融合而完成细胞培养。期间，每天用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况，并做好记录。 142胶原酶消化法方法基本同141，仅是消化时间较为宽松，为5070min，其间可
7、不用换液。用此种方法培养时，不用含血清的培养液终止消化，因血清仅可抑制胰酶的作用，对胶原酶无影响。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能会有一些上皮细胞团尚未被完全消化开。成小团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必再做进一步消化处理。消化时观察，如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。 143胰酶和胶原酶联合消化培养方法基本同141，消化时间为3545mill，消化时向离心管中分别加入3ml0.25胰酶及0.1的胶原酶液。 15统计学方法 SPSSll5软件包分析相关数据，采用卡方检验、单因素方差分析、口检验。结果均以(x
8、s)表示，显著性水准为=0.05。 2结果 21细胞生长状况 15例胰蛋白酶消化法培养，8例培养成功，4例为消化时间偏长导致细胞无法贴壁生长，1例为真菌感染，2例为细菌感染；15例胶原酶消化法培养，11例培养成功，1例为操作过程中污染，2例为细菌感染，1例感染支原体；15例联合消化法培养13例成功，1例取材时污染，1例感染真菌。 22不同消化方法的比较 221成功率比较联合消化组较单用胰酶组培养成功率高，差异具有统计学意义。胶原酶组与联合消化组的成功率比较。差异无统计学意义。结果见表2。 222消化时间比较消化时间以胰酶组时间最短，胶原酶组最长，与胰酶组和胶原酶联合组比较，均有显著性差异；3组
9、酶消化后的细胞贴壁时间无明显差异；3组酶消化后的细胞单层汇聚时间无明显差异。 223镜下比较将单细胞悬液接种后，于倒置显微镜下观察。3组酶消化后的细胞形态无明显差异，细胞贴壁及生长速度均无明显差异(p0.05)。消化后的间质细胞呈单个细胞状，子宫内膜腺上皮呈管状或葡萄状，见图1。2h已开始贴壁，呈伸展、挺直状，多数为梭形，有多个短小胞浆突起，核圆居中，细胞平铺生长。接种3d后，细胞出现漩涡状排列，成团生长，边界清楚，排列紧密，胞浆呈颗粒状，核圆而大，核仁明 显。细胞接种约7d融合成片，即单层汇聚。 3讨论 子宫内膜完整的组织复杂性，妨碍了对子宫内膜间质细胞和上皮细胞功能上分别进行关键性分析。国
10、外学者用子宫内膜细胞体外培养模型，已开展了许多方面的研究，而国内研究项目较少。子宫内膜细胞体外培养技术可用于妇产科、生殖医学、细胞生物学及分子细胞学等多种研究领域。目前，活体子宫内膜的不同成分可以通过改变内分泌环境单独或协同地对刺激进行反应。 31内膜细胞体外培养技术 人子宫内膜含大量的间质细胞和腺上皮细胞，提取分离纯化通常采用离心分离和筛网过滤的方法。内膜间质细胞与腺上皮细胞在体外培养存活时间的长短以及能否被传代，在很大程度上取决于培养中的纯度及密度。高纯度、高密度的间质细胞和上皮细胞往往有利于体外生长和传代培养。间质细胞体积较小，通过多次的不同孔径的细胞筛多次过滤可达到分离纯化的目的。但是
11、具体实验操作中发现此种方法损失的细胞较多，步骤复杂，而且对细胞的存活能力也有影响。通过离心法分离细胞，简化了操作步骤，减少了细胞损伤。且本实验采用逐次换液法除去不贴壁的血细胞，效果良好，并排除了其他干扰因素对细胞培养的影响，使原代培养细胞尽可能减少在体外的损伤，同时获得较高纯度的细胞，接种后24h即表现出正常生长旺盛细胞的形态特征，能够更好地进行体外研究。 32研究结论 本研究发现用胶原酶和胰蛋白酶及两种酶联合应用都能成功地消化子宫内膜细胞并进行体外培养，并且培养后的细胞形态及生长都无明显差异，但3种方法在消化时间方面有显著性差异(P0.01)。胰蛋白酶价廉经济，但消化时问要控制好，时间稍长就
12、可能导致细胞活性低，间质细胞不贴壁，从而导致细胞培养失败，培养的成功率略低。而胶原酶消化子宫内膜的时间较松，消化下的细胞活力比胰蛋白酶强，只是价格昂贵，来源紧张。然而采用两种酶联合消化法，相对于单用胰酶消化法可提高细胞培养的成功率，较单用胶原酶可缩短消化时间，降低培养成本，更具有优势。 33影响分离和培养结果的因素分析 331取材途径细胞离开体内环境后，由于失去了机体免疫系统的保护，易受到培养环境中细菌的污染。子宫内膜可通过刮宫和通过剖腹子宫切除后直接刮取获得，但因刮宫取得的子宫内膜易受阴道细菌的污染，可能导致培养失败嗍。所以取材前应严格消毒，再用无菌生理盐水清洗1次，然后用无菌的一次性内膜取
13、样器刮取，尽量避免接触阴道壁，以达到无菌原则而不影响内膜的活性。此外，应增加标本的冲洗次数，冲洗标本不仅可以洗去血块和黏液，还可以冲去病原体删。 332取材时间取材时间选择在月经的前半周期。月经干净后37d时，子宫内膜处于增生期，增生期子宫内膜腺体逐渐生长，月经前达到最高峰。本研究结果表明，增生期取得的标本，腺上皮细胞很少，主要为基质细胞。而在分泌期取得的标本，则可得到较多的腺上皮细胞，基质细胞相对较少。 333离心次数及转速在子宫内膜细胞分离培养中，离心的次数越多，细胞丢失亦越多，也会影响细胞活性。而离心转速较高时，同样会影响细胞的活性，均可导致细胞损伤增强，造成培养成功率的下降。所以在本研究中，离心次数不超过4次，而离心转速最高为900r/min，尽量减少对细胞的损伤，提高培养成功率。 334控制消化时间控制消化时间及浓度，以避免将腺体消化过度为活性差的单细胞，或消化不足而导致获得腺体数过少。已消化下来的细胞团或单个细胞不能耐受酶的作用，活性降低，分次把已消化下来的细胞从酶液中分离出来可保护细胞，提高其存活率。随着消化时间的延长，细胞之间的连接逐渐被消化，被消化的组织不再耐受高浓度酶的消化。因此，二次以后的消化降低了酶的浓度，从而提高了细胞的产量及活性。第 8 页 共 8 页
