1、质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定,Extraction and Identification of Plasmid DNA,实验流程图,一、碱裂解法提取质粒,三、质粒酶切,二、质粒定量,四、酶切产物的琼脂糖电泳检测,最后做,掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定DNA的方法 了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术,实验目的,pMD18-T,实验材料,大肠杆菌DH5a菌株pMD18-T载体Axygen质粒小量提取试剂盒,Takara EcoRI 限制性内切酶Takara Hind III 限制性内切酶Takara 10 M 酶切缓冲液,BioWest电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳
2、缓冲液EB 核酸荧光染料Takara 6 电泳上样缓冲液,实验仪器,微量移液器离心机恒温水浴箱紫外检测仪电泳仪水平电泳槽,独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子基因工程常采用的载体,一、碱裂解法提取质粒DNA,碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；质粒DNA释放法；酸酚法等,质粒提取方法：,碱裂解法基本原理,基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。,染色体DNA：氢键断裂，变性。质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。（不完全变性）,质粒DNA：复性，溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成缠连的网状结构。,pH =1
3、2.6（碱性）,NaAc溶液 （pH4.8）,pH=中性,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,离心,pMD18-T,溶液S1（细菌悬浮液）裂解液S2中和液S3去蛋白液W1漂洗液W2洗脱液RNase A(100mg/ml)DNA吸附柱,试剂盒的组成：,溶液S1： 50 mmol/L葡萄糖 10 mmol/LEDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS中和液S3： 3 mol/L KAc (pH4.8)溶液,实验流程,1.5mL 菌液,12000rpm,1 min,菌
4、体沉淀,溶液S1,250l,剧烈震荡,裂解液S2,250l,颠倒混匀4-6次,中和液S3,350l,温和地颠倒混匀6-8次,12，000rpm10 min,室温静置2min,至出现白色絮状沉淀,取700l上清至吸附柱管,12，000rpm30s,12，000rpm30s,漂洗液W2,600l,12，000rpm30s,12，000rpm2 min,取吸附柱至另一新EP管,洗脱液Eluent,50l,12，000rpm1 min,室温静置1min,弃滤液空柱,收集洗脱液备用,去蛋白液W1,600l,弃滤液,弃滤液,2. 悬浮细胞,1. 收集细胞,3. 裂解细胞,4. 中和,6. 洗柱,7. 洗脱
5、,5. 过柱分离,二、质粒DNA定量测定,利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性,基本原理,紫外分光光度计,操作步骤,取5l提取的质粒DNA，加入95l蒸馏水 混合均匀3. 用紫外分光光度计测定A260,DNA或RNA的定量A260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸,紫外光吸收法：,DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,DNA或RNA的纯度判定,数据处理,Ratio值A260/A280,三、质粒DNA的酶切分析,质粒 DNA: 3 kb 载体: pMD18-T 2.7kb
6、基因: CHD5 0.4 kb,限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为46个核苷酸的反向重复序列。,限制性内切酶,EcoR和Hind的识别序列和切口是： EcoR：GAATTC Hind：AAGCTT,pMD18-T,在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：,混合后37 水浴12h,质粒DNA的酶切分析操作,影响酶切反应的因素,底物DNA的纯度反应系统：(反应缓冲液)反应体积： 甘油浓度5%保温时间与温度,四、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶,琼脂糖（Agarose ）是一种
7、多聚糖，由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,电泳：带电粒子在电场中泳动的现象,影响迁移率的因素？,电场,样品：,大小（分子量）形状（构型）电荷,共价闭环超螺旋DNA线性DNA开环的双链环状DNA,质粒DNA三种构型：共价闭环超螺旋线性开环的双链环状,本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围,琼脂糖凝胶的制备上样：加样前，样品先与6上样缓冲液混匀电泳 ：电压100v；30min结果观察：凝胶成像仪,琼脂糖凝胶电泳操作,琼脂糖凝胶电泳,1. 凝胶准备 称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5TBE
8、 100ml ； 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；2. 胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；铺胶：将冷却至60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；,向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6 l ；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间2530分钟
9、；电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13. 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。,琼脂糖凝胶电泳上样,1：DNA Marker（ 5 l ）2：提取的质粒DNA （ 5 l ）3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）,每组上2个样品,DNA Marker (ladder),Loading Buffer上样缓冲液,EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚蓝指示剂二甲苯胺蓝指示剂,组成,0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率 溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝=4kbp,染色溴化乙锭(EthidiumBromide，EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,优点：染色操作简便，快速；灵敏度高缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套),1 2,M,3 4,5 6 7,5000300020001000,bp,M: DNA Marker DL5000 PCR 产物; 2. PCR 产物3. 质粒DNA; 4. 质粒 DNA5. 酶切产物; 6. 酶切产物,结果分析,
