1、 苦参碱抑制人雄激素非依赖性 PC3 细胞增殖和诱导凋亡的研究作者：张鹏，王子明，纪宗正，种铁，黄辰，高彩霞【摘要】 目的 研究苦参碱对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3 增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法 不同浓度苦参碱作用 PC3 细胞后，应用 MTT 法观察苦参碱对 PC3 细胞增殖的影响，流式细胞仪研究苦参碱对 PC3 细胞周期的影响，TUNEL 法、Annexin V/PI 双染分析苦参碱对 PC3 细胞凋亡的影响。结果 苦参碱对 PC3 细胞的生长具有抑制作用，与对照组相比有统计学差异(P0.05)。苦参碱对 PC3 细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。苦参碱的最佳药物
2、浓度为 1.0g/L，最佳作用时间为48h。流式细胞仪分析显示不同浓度苦参碱均可使 PC3 细胞阻滞于 G0/G1 期，随着苦参碱浓度的增加，G0/G1 期细胞所占的比例增加，与对照组相比有统计学差异(P0.01)。TUNEL 法、Annexin V/PI 分析显示不同浓度苦参碱均可诱导 PC3 细胞凋亡，其早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，呈现剂量依赖性关系(P0.05，P0.01)。结论 苦参碱在体外可抑制 PC3 细胞的增殖，具有时间和浓度依赖关系。抑制增殖和细胞周期阻滞与G0/G1 期相关。苦参碱可诱导 PC3 细胞凋亡，与苦参碱的作用浓度及时间有关。 【关键词】 前列
3、腺癌;苦参碱;细胞凋亡ABSTRACT: Objective To investigate the effects of matrine on the proliferation, cell cycle, apoptosis of androgen independent prostate cancer (AIPC) cell line PC3 in vitro. Methods PC3 cells were treated by different concentrations of matrine. The inhibitory effect of matrine on the proli
4、feration of PC3 cells was observed by MTT method. The cell cycle of PC3 cells treated by matrine was observed by flow cytometric assay. Apoptosis of PC3 cells induced by matrine was determined with TUNEL and Annexin V/PI staining assay. Results MTT test showed that PC3 cells treated by matrine had a
5、n inhibitory effect, which was significantly different from that of controls (P0.05). Matrine markedly inhibited cell proliferation of PC3 in dose and timedependent manners. The optimal dose of matrine which inhibited PC3 cells was 1.0g/L and the best time of inhibition was at 48h. Flow cytometric a
6、ssay showed that the PC3 cells treated by different doses of matrine were arrested in cell cycle progression at G0/G1 phase. The cell ratio at G0/G1 phase increased with the increase of matrine dose, which was significantly different from that of controls (P0.01). TUNEL and Annexin V/PI staining ass
7、ay showed that matrine could obviously induce the apoptosis of PC3 cells. The ratio of early and late apoptosis of PC3 cells treatedby matrine was increased in a dose dependent manner (P0.05, P0.01). Conclusion Matrine could inhibit the proliferation of PC3 cells in dose and timedependent manners in
8、 vitro. The inhibition mechanism was associated with arresting cell cycle at G0/G1 phase. Matrine could induce the apoptosis of PC3 cells, which might be associated with the dose and action time of matrine.KEY WORDS: prostate cancer; matrine; apoptosis 雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cance
9、r, AIPC)是前列腺癌进展的致命形式。目前对 AIPC 的治疗主要采用化疗，患者生存期一般不超过 1 年。苦参碱(matrine, MA)是中药苦参的主要有效成分1。研究表明苦参碱对肺癌、卵巢癌等的细胞生长具有抑制作用2 3，这种作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。本实验通过不同浓度的苦参碱作用于 AIPC 细胞株 PC3，研究苦参碱对 PC3 细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株 人 AIPC 细胞株 PC3 由西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室提供。该细胞系来源于一位 62 岁白人男性前列腺癌患者的骨转移灶，其酸性磷酸酶和 5还原酶活性
10、低，不产生前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)，不表达雄激素受体。1.1.2 主要试剂 苦参碱由西安鸿生生物科技有限公司惠赠，纯度980g/L。胎牛血清、RPMI1640 培养液、四甲基偶氮唑蓝溶液(MTT)、碘化吡啶(PI) 均购自美国 GIBCO 公司。二甲亚砜(DMSO)购自美国 Sigma 公司。TUNEL 检测试剂盒、 SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德公司。Annexin V/FITC apoptosis detection kit 购自美国 BD 公司。1.1.3 主要仪器 高通量多功能微板测试系统购自德国 BMG L
11、ABTECHNOLOGIES 公司。FASCalibur 型流式细胞仪购自美国FALS CALIBAR BD 公司。TCS SP2 型激光扫描共聚焦显微镜购自德国 LEICA 公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 在 37、50mL/L CO2 环境下，将 PC3 细胞培养于含 100mL/L 灭活 FBS 的 RPMI1640 培养液中。取对数生长期细胞，2.5g/L 的胰酶消化成单细胞悬液进行实验。1.2.2 MTT 法检测苦参碱对 PC3 细胞增殖活性的影响 将单细胞悬液以每孔 5104 个细胞的密度接种于 96 孔培养板，每孔0.1mL，培养 24h，使细胞贴壁，加入苦参碱，使其终质
12、量浓度分别达到 0.5、1.0、1.5、2.0g/L ，另设调零孔和阴性对照孔，每组设 5 个复孔，培养 12、24、48、72h 后每孔分别加入 5g/L MTT 溶液20L，孵育 4h，吸弃上清液，每孔加入 150L DMSO，振荡15min，在高通量多功能微板测试系统 490nm 波长处测得各孔吸光度(A) 值，此实验重复 3 次，取其均值。计算细胞增殖抑制率(%)=1-(A 苦参碱组-A 空白对照组)/(A 阴性对照组 -A 空白对照组)100%。1.2.3 细胞周期测定 将单细胞悬液以每孔 5105 个细胞的密度接种于 6 孔培养板，每孔 1mL，孵育 4h，加入苦参碱，使其终浓度分
13、别达到 0.5、1.0、1.5、2.0g/L ，另设阴性对照孔，每组设 2 个复孔，培养 24h，收集悬浮及贴壁细胞，750mL/L 乙醇固定，-20 保存。检测时，离心弃乙醇，洗涤后加入 PI 染色缓冲液(50g/L PI 和15g/L RNase)，避光染色 20min，流式细胞仪检测 DNA 含量，进行细胞周期分析及凋亡检测，用 FACSort Cell Quest 软件( 美国 BD 公司)做 DNA 分析。1.2.4 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL) 将单细胞悬液以每孔 5105 个细胞的密度接种于 24 孔培养板，每孔中预先放入 1 枚 25mm2 盖玻片
14、，孵育 4h，加入苦参碱，使其终浓度分别达到 0.5、1.0、1.5、2.0g/L，另设阴性对照孔，每组设 3 个复孔，培养 24h，洗涤细胞爬片，40g/L 多聚甲醛室温固定30min，30mL/L H2O2 处理 10min，Triton X100 处理 30min，洗涤后每张爬片加 20L 含 TdT 和 DIGdUTP 标记缓冲液，孵育2h，洗涤后每张爬片加封闭液 50L，孵育 30min，弃封闭液。加生物素化抗地高辛抗体，孵育 30min，洗涤，加 SABC 孵育30min。DAB 显色，脱水、透明、封片。细胞核被染为棕黄色者为阳性细胞。每张爬片随机取 5 个高倍视野(400)，并进
15、行阳性细胞计数。1.2.5 Annexin V/PI 双染色分析 将单细胞悬液以每孔 5105 个细胞的密度接种于 24 孔培养板，孵育 4h，加入苦参碱，使其终浓度分别达到 0.5、1.0、1.5、2.0g/L ，另设阴性对照孔，每组设 2 个复孔，培养 24h，Binding buffer 洗涤细胞，加入 1mL Binding buffer、5L Annexin VFITC 和 5L PI 溶液。孵育 15min，流式细胞仪检测分析，用 FACSort Cell Quest 软件做 DNA 分析，488nm 氩离子激光器激发，激光共聚焦显微镜取图。1.3 统计学分析 所获资料用 SPSS
16、10.0 统计学软件进行方差分析，结果以s 表示，当 P0.05 时为差异有统计学意义。2 结 果2.1 苦参碱对 PC3 细胞增殖的影响 苦参碱作用 PC3 细胞 1272h 后，MTT 法观察细胞吸光度(A 值)变化，通过公式计算出细胞生长抑制率(表 1)。苦参碱对 PC3 细胞的生长具有明显的抑制作用，随着苦参碱浓度的增加、作用时间的延长，其增殖抑制作用增强。0.5、1.0、1.5、2.0g/L 浓度苦参碱组的生长抑制率与对照组相比均有统计学差异(F=8.372，P0.05); 同一浓度苦参碱在作用12、24、48、72h 时的生长抑制率与对照组相比亦均有统计学差异(F=13.220，P
17、0.05)，苦参碱对 PC3 细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。苦参碱作用 PC3 细胞后其生长抑制率有统计学差异的最低浓度为 1.0g/L，此为苦参碱作用的最佳药物浓度。在作用 48h 时苦参碱对 PC3 细胞的增殖抑制作用最强，在 72h 后抑制作用开始减弱，苦参碱最佳作用时间为 48h。表 1 苦参碱对PC3 细胞生长抑制率的影响 2.2 苦参碱对 PC3 细胞周期的影响 苦参碱作用 PC3 细胞 24h 后，流式细胞仪分析细胞周期变化( 表 2)。不同浓度苦参碱均可导致 PC3 细胞被阻滞于 G0/G1 期，随着苦参碱浓度的增加，G0/G1 期细胞所占的比例总体呈现增加趋势，
18、与对照组相比有统计学差异(F=32.659, P0.01)，同时伴随着 S 期和G2/M 期细胞比例的下降。细胞凋亡分析在图 1 中均可检测到细胞凋亡峰，其为位于 G0/G1 峰前面的亚二倍体峰，随着苦参碱浓度的增加，细胞凋亡率(表 2、图 1)总体呈现上升趋势，与对照组相比有统计学差异(F=89.202，P0.01)。2.3 TUNEL 检测结果 苦参碱作用 PC3 细胞 24h 后，TUNEL 法检测细胞凋亡情况( 表 3、图 2)。不同浓度苦参碱均可使PC3 细胞发生细胞凋亡，随着苦参碱浓度的增加，细胞凋亡数增加，呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(F=12.751，P0.0
19、1)。表 2 苦参碱对 PC3 细胞周期分布及细胞凋亡率的影响表 3 苦参碱对 PC3 细胞凋亡的影响2.4 苦参碱作用 PC3 细胞的 Annexin V/PI 双染色分析 苦参碱作用 PC3 细胞 24h 后，Annexin V/PI 双染色分析细胞凋亡情况(表 4、图 3)。不同浓度苦参碱均可使 PC3 细胞发生细胞凋亡，PC3 细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(F=4.771, P0.05;F=18.642, P0.01)。同一浓度苦参碱引起 PC3 细胞早期凋亡率与晚期凋亡率之间无统计学差异(P0.05)。苦参碱作
20、用后，PC3 细胞出现了不同程度的坏死，随着苦参碱浓度的增加，坏死细胞比例增加，与对照组相比有统计学差异(F=11.410, P0.01) 。表 4 苦参碱对 PC3 细胞凋亡的影响3 讨 论细胞过度增殖是恶性肿瘤的生物学特性之一，对癌细胞生长抑制的程度可反映肿瘤的治疗效果。为了研究苦参碱对 PC3 细胞是否具有增殖抑制作用，我们采用 MTT 法观察了不同浓度苦参碱对PC3 细胞体外增殖作用的影响。结果显示，不同浓度苦参碱均可使 PC3 细胞数量减少、细胞增殖受到抑制，这种抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强，与对照组相比均有统计学差异(P0.05);同一浓度苦参碱作用不同时间的生长抑制率亦随着
21、时间的延长而增高，与对照组相比均有统计学差异(P0.05)，苦参碱对 PC3 细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。这与部分学者关于肝癌、胃癌等的研究结果相一致45。实验显示苦参碱在体外对PC3 细胞有较强的细胞毒性作用。选择 PC3 细胞增殖受到明显抑制的最低浓度 1.0g/L 作为苦参碱的最佳药物浓度 ;选择 PC3 细胞增殖抑制作用最强的时间 48h 作为苦参碱的最佳作用时间。细胞周期与细胞的增殖密切相关。细胞周期的长短主要取决于 G0/G1 期，G0/G1 期阻滞可使细胞增殖周期延长，增殖速度减慢。细胞周期阻滞，是细胞对各种损伤因素的正常反应，可使细胞在进入 S 期或 M 期前有
22、足够的时间修复受损的 DNA，如果 DNA 损伤不能修复，则诱导细胞凋亡。本研究发现，不同浓度苦参碱作用 24h后均可使 PC3 细胞被阻滞于 G0/G1 期。随着苦参碱浓度的增加，G0/G1 期细胞所占的比例总体呈现增加趋势，与对照组相比有统计学差异(P0.01)，同时伴随着 S 期和 G2/M 期细胞比例的下降。细胞凋亡率亦随着苦参碱浓度的增加而上升，与对照组相比有统计学差异(P0.01)。这与细胞增殖抑制实验的结果相一致，表明苦参碱使细胞无法从 G1 期进入 S 期，堆积在 G0/G1 期，出现 G2/M 阻滞，阻止细胞进行有丝分裂，从而抑制细胞的增殖。凋亡是中药抑制肿瘤细胞增殖的一条很
23、重要的途径。本实验采用 TUNEL 法及 AnnexinV/PI 双染色法进行 PC3 细胞凋亡的检测，TUNEL 法研究显示，不同浓度苦参碱均可使 PC3 细胞发生细胞凋亡，凋亡细胞数与苦参碱浓度之间呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(P0.05)。AnnexinV/PI 双染色法研究显示 PC3 细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，与对照组相比均有统计学差异(P0.05)。这说明苦参碱对PC3 细胞凋亡的影响有剂量依赖性，既可增加细胞的早期凋亡率，也可增加细胞的晚期凋亡率，苦参碱具有诱导加速 PC3 细胞凋亡的作用。进一步研究发现，随着苦参碱药物浓度的增加和作用时间的延长，PC3 细胞的坏死比例显著增高。这可能是因为不同的药物浓度和作用时间对细胞产生的抑制效应不同，大剂量或长的作用时间也易导致细胞坏死而非凋亡，相对较小剂量和短时间作用更易引起细胞自身内部的改变。以上研究表明，苦参碱在体外能显著抑制人 AIPC 细胞系PC3 细胞株增殖并诱导细胞凋亡。【
