1、 介孔二氧化硅纳米材料制备及在生物学方面之功能化分析第一章绪论材料是人类赖以生存和发展的物质基础，是人类物质文明和社会进步的主要标志。进入 20 世纪 80 年代人们把信息、材料和能源誉为现代科学技术的三大支柱，其作用和意义尤为重要。在不断涌现出的各种材料中，介孔纳米材料引起广大研究者的极大兴趣和关注，并在吸附、分离、催化、传感、生物工程和纳米分子器件等诸多方面显示了巨大的应用前景。1.1 介孔材料简介按照国际纯粹和应用化学协会 (IUPAC) 的定义，多孔材料可以根据它们孔直径 d 的大小分为三类：d 2 nm 的多孔固体材料为微孔材料 (microporous materials)；孔径在
2、 2 nm d 50 nm 的多孔固体材料为介孔材料 (mesoporous materials)；孔径 d 50 nm 的多孔固体材料为大孔材料 (macroporous materials)。1.1.1 介孔材料的结构特性有序的介孔材料的合成早在 1970 年代就已经开始。 但直到1992 年 Mobil 公司报道 M41S 有序介孔材料的合成之后，有关介孔材料的研究才引起广泛关注。Mobil 公司采用长链烷基季铵盐表面活性剂为模板剂。以硅酸盐为硅源，合成出了具有高度有序孔道结构的 M41S 系列介孔硅酸盐材料，包括 MCM-41 (六方相) 、MCM-48 (立方相) 和 MCM-50
3、(层状结构)。Fig. 1.1 为 M41S 介孔材料的结构示意图。可以看出，MCM-41 具有一维六方对称性排列的直孔道；MCM-48 具有三维螺旋交叉孔道；MCM-50 为无机有机交替排列的层状相。MCM-41 和 MCM-48 的孔道尺寸分布很窄，孔径大于 2 nm，比表面积超过 1000 m2/g，而层状结构的 MCM-50 会因为表面活性剂的去除而造成结构塌陷变成无定形相，研究较少。由于介孔材料具有高度有序的孔道结构、均一且可调变的孔径、较高的比表面积 (7001500 m2/g) 和较大的孔体积 (0.81.2 cm3/g)、窄的孔径分布、可控的形貌特征、表面可进行基团功能化等一系
4、列优点，因而，它们在吸附、分离、催化、传感器、生物医学、环境保护以及纳米材料的合成等诸多领域表现出其他多孔材料无可比拟的优越性和应用潜力。1.1.2 介孔材料的合成典型的介孔材料合成分为以下两步：1. 有机-无机液晶相介观结构）的生成是利用具有双亲性质的表面活性剂与可聚合的无机单体分子或齐聚物在一定条件下自组装生成有机物与无机物的液晶织态结构相，此结构相具有纳米尺寸的晶格常数。2. 利用高温热处理或其他物理化学方法脱除表面活性剂，所留下的空间即构成介孔孔道。介孔材料的合成具有操作简单，可控性强等特点， 为介孔材料的进一步功能化和应用提供了坚实基础。1.1.3 介孔材料的修饰对介孔材料表面进行修
5、饰，将功能物质组装到介孔材料的孔道中，使介孔材料功能化，是提高介孔材料在更多领域里应用的有效途径。介孔材料表面含有丰富的硅羟基，很容易与其他有机功能团作用，使有机功能团通过共价键结合的方式嫁接于介孔材料的孔壁上。目前，氨基、烷基、巯基、羧酸、硫醇与过渡金属复合物等功能团已经被成功的引入到介孔孔道中。常用的表面修饰方法有两种：一步合成法与后修饰的方法。一步 (one-pot) 合成法是将硅烷偶联剂与无机硅源共同加入到反应体系中，在介孔结构生成的同时将有机功能团直接引入孔道中。该方法简单易行，但是对于一些在酸碱性条件下不稳定的基团则不适用。同时如果有机官能团引入量过大，将影响孔道结构的形成，最终破
6、坏介孔材料的结构。所以，一步合成的方法只适用于合成具有稳定官能团且组装量不大的材料。后修饰 (post-synthesis) 的方法是用有机硅试剂与已合成的介孔材料在有机溶剂中回流，通过硅羟基与硅烷偶联剂的水解缩合，在介孔中引入官能团的方法。后修饰法一般在 N2 的保护下进行，防止硅烷偶联剂自身水解与聚合，整个修饰过程不会对介孔材料主体的孔径与结构造成破坏。功能化程度能够很好的通过控制硅烷偶联剂的量来控制，所以使用后修饰的方法更为广泛。第二章 介孔二氧化硅纳米材料 MSNs）的合成、氨基化及与质粒 DNA 作用的研究2.1 引言近年来，介孔二氧化硅纳米材料 (MSNs) 在生物工程和生物医学领
7、域方面的应用得到了广泛的研究与探讨。结果表明 MSNs 在药物可控释放、药物、生物传感系统、细胞内标记以及基因转染等方面具有极大地应用潜力。所谓基因转染，就是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。其中，核酸包括 DNA 质粒和线性双链 DNA），反义寡核苷酸及 RNAi (RNA interference)，而质粒 DNA (plasmid DNA, pDNA) 是一种常用的外源目的基因载体。由于基因自身不能直接进入细胞，需要一定的转染试剂将带有目的基因载体运送到细胞内实现基因转染。相关研究表明：MSNs 作为一种转染试剂在提高 pDNA 体外和体内的转染效率方
8、面具有很大的潜力，这将为基因治疗提供了一种新的途径。DNA 在转染试剂上的吸附是基因转染研究中一项基本而重要的工作。很多科研人员已探索了 DNA 在介孔材料上吸附性能。Landry 等人研究了双螺旋线性 DNA 在介孔材料上的吸附，实验结果对基因转染有着重要的意义。相关的研究还有 Lehr 研究组报道的二氧化硅纳米材料无孔道）对 pDNA 的吸附，以及 Corma 研究组报道的 FDU-12 型、氨基化、大孔径 (20 nm) 的MSNs 对 pDNA 的吸附，他们的实验结果均显示二氧化硅纳米材料对 pDNA 具有高吸附和完全保护的性质。自 1992 年 Mobil 公司研究的 M41S 系列
9、介孔材料问世以来，由于其具有较高的比表面积、较窄的孔尺寸分布、较大的孔体积、可调控的孔径以及易被其他分子和基团修饰的特点，在吸附，分离、催化等诸多领域受到了广泛的应用。由于 MSNs 的纳米尺寸使其容易被细胞吸收，因此，在生物工程和生物医学方面，尤其是在基因和药物载体研究方面得到了更广泛的关注。然而，对 MCM-41 型MSNs，关于 pDNA 吸附的性质等方面的研究还很少。据文献报道氨基化的 MSNs 对 pDNA 吸附量很高 98，但就硅烷修饰量对 pDNA 吸附及保护的影响还未见报道。本章以 MCM-41 型 MSNs 为研究对象，通过调变 TEOS 和 NH3H2O 的加入量，可控地合
10、成了一系列不同粒度的 MSNs。分别选取粒度为 80 nm、200 nm 和 320 nm 的 MSNs，对 pDNA 的吸附和保护性质进行了研究。同时以氨基化的 MSNs(80 nm) 为基因载体，对质粒 PEGFPN3 的转染进行了初步探索。第三章 功能化的介孔二氧化硅纳米材料生物. 60-763.1 引言 .60-613.2 三种功能化的介孔二氧化硅纳米材料. 61-713.2.1 壳聚糖 (Chitosan) 修饰.61-653.2.2 羟基磷灰石包裹的 MSNs . 65-683.2.3 PEG 修饰的 MSNs 的合成.68-713.3 三种功能化的 MSNs 的生物相容性. 71
11、-753.3.1 三种功能化的 MSNs 的细胞活性. 71-733.3.2 三种功能化的 MSNs 被细胞内吞性能. 73-753.4 本章小结. 75-76第四章 单分散的中空介孔二氧化硅壳纳米材.76-844.1 引言 .764.2 单分散的 HMSNs 的合成. 76-794.2.1 实验部分 .76-774.2.2 HMSNs 的表征. 77-794.3 HMSNs 的生物相容性的研究 .79-814.3.1 HMSNs 细胞活性试验. 79-804.3.2 HMSNs 被细胞内吞的性. 80-814.4 本章小结. 81-84第五章 结论与展望. 84-86结论本文以介孔二氧化硅纳
12、米材料为研究对象，主要阐述了其与 pDNA 的相互作用，功能化的介孔二氧化硅纳米材料的合成和生物相容性的研究。另外对单分散的中空介孔二氧化硅壳纳米材料的合成和生物相容性也做了初步研究。主要研究成果如下：1. 通过调变 TEOS 和 NH3H2O 的加入量，合成了一系列不同粒度的介孔二氧化硅材料。粒度尺寸控制在 80-320nm 范围内。2. 系统地研究了不同硅烷含量的 Am-MSNs-80 的合成与表征，并在此基础上探讨了这一系列产物吸附和保护 pDNA 的性质。研究结果表明不同硅烷含量的 Am-MSNs 都能够很好地吸附 pDNA，并且随着 Am-MSNs 上 APTES 修饰量的逐渐增多，
13、 pDNA 的吸附量也逐渐增加。对于 pNDA 保护的研究表明，过多或过少的硅烷量都不能有效地保护 pDNA，而适量的硅烷却能有效地保护 pDNA,使其不能够被酶消化。也就是说含有适量硅烷的 Am-MSNs 即能很好地吸附 pDNA，又能有效地保护 pDNA。3. 在此基础上，我们又进一步研究了含有适量硅烷的 Am-MSNs 样品 4 吸附和保护其他的 pDNA，如 pcDNA3.1(+)-PKB-HA 和 PEGFPN3 的性质，也得出了同样的结论。另外，又以该样品作为载体，进行了转染 PEGFPN3 的初步研究。结果表明样品 4 能够把 PEGFPN3 转进细胞中，尽管转染效率很低，但是说
14、明该材料有作为基因载体的可能。4. 研究了不同 APTES 含量的，粒度分别为 200 nm 和 320 nm 的介孔二氧化硅纳米材料吸附与保护 pcDNA3.1(+) 的性能。与 Am-MSNs-80 的结果基本一致，但吸附和保护的程度呈变弱趋势。这表明 APTES 的量是影响材料吸附和保护 pDNA 的主要因素，同时介孔材料的粒度对于吸附和保护 pDNA 也起着一定的作用。5. 合成了三种功能化的介孔二氧化硅纳米材料，分别为 Chitosan 修饰的 MSNs、HA 包裹的 MSNs 和 PEG 修饰的 MSNs，三种材料均为双功能化，连有 FITC 荧光剂是用于细胞标记，也用于流式检测细
15、胞内吞能力。连有功能性的分子 (Chitosan, HA 和 PEG)是为了提高材料的生物相容性。MTT 细胞活性试验和细胞内吞试验表明：与 Chitosan 修饰的 MSNs 相比、PEG 修饰的 MSNs 和 HA 包裹的 MSNs 具有更高的生物相容性和细胞内吞能力。这说明介孔二氧化硅纳米材料的功能化基团对其在生物医学上的应用起着重要的作用。6. 合成了纳米尺寸、多分散性较好的中空介孔二氧化硅壳纳米材料。对细胞活性的检测表明其较好的生物相容性。细胞内吞的试验表明 HMSNs 具有较高的被细胞吸收的能力。对于 HMSNs，我们还需进一步研究其分散性，并进行功能化，以期具有优异的生物相容性和细胞内吞能力,而作为药物载体应用于生物医学方面。介孔材料的问世以来，其迅猛发展的同时又与物理、化学、生物、医药等其它科学的交叉融合，也赋予介孔材料科学新的发展机遇。展望未来，我们认为介孔纳米材料的进一步发展尤其应用于生物医学上还需在以下几个方面努力：(1)介孔纳米材料及中空介孔二氧化硅壳纳米材料的多分散性问题。具有单分散性的材料才能被细胞高效吸收，是应用于生物医学的基础和前提。 (2) 利用介孔材料独特的结构优势，继续开发多功能介孔材料。(3) 介孔材料在体内的研究目前还比较有限的，在体外研究的基础上，进一步对体内各项指标进行检测，是实现介孔材料在生物医学上的实际应用的有效途径。
