1、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素生物素法（SAP法）,免疫组织化学实验二,实验材料,1、小鼠胰腺的石蜡切片； 2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）； 3、SAP检测试剂盒； 4、正常羊血清； 5、 0.01M PBS（pH7.27.6） ； 6、BCIP/NBT显色试剂； 7、孵育湿盒。,实验原理,ABC法,SAP法,实验方法或步骤,1、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，PBS浸泡2min；(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 2、10正常羊血清封闭，室温孵育10min； 3、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工作液，37孵育45min。 PBS冲洗，3×3min； 4、滴加生物
2、素标记羊抗鼠IgG工作液，37孵育20min； 5、 PBS冲洗，3×3min； 6、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液，37或室温孵育20min。 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（BCIP/NBT）； 8、自来水充分冲洗，封片。,结果,胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质,多聚鳌合物酶法HRP-多聚化合物-抗体 一、Epos法Enhanced polymer one-step staining,组织抗原,一抗,HRP,多聚化合物骨架,EPOS 方法,原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，
3、形成HRP-多聚化合物-特异性抗体。,步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵,二、EnVision法（或PowerVison）Enhanced Labelled Polymer System原理：HRP -多聚化合物-第二 抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚化合物骨架,第一步,第二步,PowerVision方法,特点： 敏感性高：（每个多聚鳌合物中含70个 HRP分子和10 个第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,基本操作步骤,1. 抗原修复 2.内源性过氧化物抑制 3. 正常血清封闭,4. 第一抗体 5. 多聚骨架复合物 6. 显色,实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min； 2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min； 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37孵育1hr； 4、 PBS冲洗，3×3min； 5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37或室温孵育2030min； 6、 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（AEC或DAB）； 8、自来水充分冲洗，封片。,结果： 胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质。,
