1、 过硫酸铵 TEMED 四甲基乙二胺 系统 在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后 过硫酸铵 NH4 2S2O8 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态 从而发生聚合作用 聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比 这种催化系统需要在碱性条件下进行 例如 在pH8 8条件下7 的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕 在pH4 3时聚合很慢 要90分钟才能完成 温度与聚合的快慢成正比 通常在室温下就很快聚合 温度升高聚合更快 如将混合后的凝胶溶液放在近0 的地方 就能延缓聚合 一般来讲 温度过低 有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合 为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合 在聚合前须将溶
2、液分别抽气 然后再混合 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein 1964 和Davis 1964 设计的 样品和浓缩胶中含Tris HCl pH6 8 上下槽缓冲液含Tris 甘氨酸 pH8 3 分离胶中含Tris HCl pH8 8 系统中所有组分都含有0 1 的SDS Laemmli 1970 样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界 在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚 此处pH值较高 有利于甘氨酸的离子化 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后 沿分离胶泳动 从移动界面中
3、解脱后 SDS 蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶 并被筛分而依各自的大小得到分离 甘氨酸 浓缩效应 凝胶由两种不同的凝胶层组成 上层为浓缩胶 下层为分离胶 浓缩胶为大孔胶 缓冲液pH6 7 分离胶为小孔胶 缓冲液pH8 9 在上下电泳槽内充以Tris 甘氨酸缓冲液 pH8 3 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性 在浓缩胶中HCl几乎全部解离为Cl 但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO 蛋白质的等电点一般在pH5左右 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间 当电泳系统通电后 这3种离子同向阳极移动 其有效泳动率依次为Cl 蛋白质 H2NCH2COO 故C1
4、称为快离子 而H2NCH2COO 称为慢离子 电泳开始后 快离子在前 在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区 电导与电压梯度成反比 所以低电导区有较高的电压梯度 这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动 在快离子和慢离子之间形成 个稳定而不断向阳极移动的界面 由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间 因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成 条狭窄带 这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍 电荷效应 样品进入分离胶后 慢离子甘氨酸全部解离为负离子 泳动速率加快 很快超过蛋白质 高电压梯度随即消失 此时蛋白质在均一的外加电场下泳动 但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同 使得各种蛋白质的泳动
5、速率不同而形成一条条区带 但在SDS PAGE电泳中 由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物 使蛋白质分子带负电荷 这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别 从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别 此外 由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位 这是因为SDS破坏了蛋白质氢键 疏水键等非共价键 与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化 在水溶液中SDS 蛋白质复合物都具有相似的形状 使得SDS PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响 因此 各种SDS 蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同 Acr Bis 产品简介 40 Acr B
6、is 39 1 即为含40 acrylamide bisacrylamide的水溶液 其中acrylamide和bisacrylamide的比例为39 1 40 Acr Bis 39 1 常用于配制各种PAGE凝胶 例如EMSA凝胶 RPA凝胶等 可以用于蛋白或核酸等的分离 是实验室的常用储备液 保存条件 4 避光保存 注意事项 40 Acr Bis 39 1 有一定毒性 使用时请注意适当防护 为了您的安全和健康 请穿实验服并戴一次性手套操作 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳 这种凝胶是以丙烯酰胺单体 Acrylamide 简写为Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 N N MethylenaBisacrylamide 简写为Bis 在催化剂的作用下聚合而成的 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的 且具有神经毒性 操作时应避免接触皮肤 但在具有自由基团体系时 它们聚合 引发产生自由基团的方法有两种 即化学法和光化学法
