1、申请级别：国家级福建省级 校级“大学生创新创业训练计划”申报书华侨大学学校名称:项目名称：抗菌肽与类弹性蛋白融合表达及其在渔业养殖中的应用项目类型：创新训练项目 创业训练项目 创业实践项目负责人：李小坤指导老师：李夏兰福建省教育厅华侨大学二。一三年四月填写须知一、项目分类说明：1 . 创新训练项目是本科生个人或团队，在校内导师指导下，自主完成创新性实验方法的设计、设备和材料的准备、实验的实施、数据处理与分析、总结报告撰写等工作。2 .创业训练项目是本科生团队，在校内导师指导下，团队中每个学生在项目实施过程中承担一个或多个具体的角色， 通过编制商业计划书、开展可行性研究、模拟企业运行、进行一定程
2、度的验证试验，撰写创业报告等工作。3 .创业实践项目是学生团队，在学校导师和企业导师共同指导下，采用前期创新训练项目（或创新性实验）的成果，提出一项具有市场前景的创新性产品或者服务，以此为基础开展创业实践活动。申报该类项目需额外提交企业导师合作指导协议书作为附件。二、申报书请按顺序逐项填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。空缺项要填“无” 。三、 申请参加大学生创新创业训练计划项目团队的人数含负责人在内不得超过5 人。四、表格中的字体小四号仿宋体， 1.5 倍行距；需签字部分由相关人员以黑色钢笔或水笔签名。均用 A4 纸双面打印，于左侧装订成册。五、 推荐上报福建省的计划项目由学校分管领导
3、在申报书上签署意见、签字并加盖公章后，一式五份（均为原件） ，报送省教育厅高等教育处。项目名称抗菌肽与类弹性蛋白融合表达及其在渔业养殖中的应用项目起止时间2013 年3 月至2014 年9 月负责人姓名学号学院专业年级联系电话E-mail李小坤1126321018化工学院11生物技术项目组成员熊小凡1126321031化工学院11生物技术吴凯伦1126321028化工学院11生物技术汪诗维1126321026化工学院11生物技术指导教师姓名李夏兰职务/职称教授所在单位华侨大学化工学院联系电话18959260391E-校外导师姓名无职务/职称无所在单位无联系电话无E-mail无、项目简介抗菌肽(
4、Antimicrobial polypeptides , AMPs足两性带电分子，广泛存在于 多种生物体内，具有广谱抗菌、调节免疫、抑制月中瘤等多种生物学功能。一些抗 菌肽不仅对耐药性的病原细菌有很好的抑制和杀灭作用，而且还对真菌、原生动 物、病毒等有很好的抑制作用。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性 致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类 型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱 广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将 会在医药工业上有着广阔的应用前景。抗菌肽产业是一个新兴的高科技生物工程和
5、生物技术产业。由于早期生物工程方法不完善，抗菌肽的天然提取极为昂贵，限制了在医药、农业、工业上的应 用。与天然提取相比，通过生物表达系统异源表达抗菌肽显著降低了生产成本， 具有良好的应用前景。但由于抗菌肽一般是一些阳离子小分子多肽，极易在蛋白 酶的作用下降解，而且表达产物往往对宿主细胞有毒性作用，易造成宿主细胞的 死亡，因此，为了降低抗菌肽对宿主细胞的毒性，同时提高其表达量、简化分离 纯化过程，抗菌肽的异源表达经常融合一些蛋白标签，其作用类似于天然抗菌肽 产生过程中能够保护抗菌肽及宿主菌的前导肽部分。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides , ELPs)是一种具有弹
6、性功能 且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。具结构主要由五肽重复序 列单元构成，即(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly , VPGXG)源自于弹性蛋白的疏水区域， 其中Xaa可以是除Pro以外任一氨基酸。ELPs有一个可逆相变过程，称之为反 转变温度(Inverse temperature transition , ITT),若环境温度低于该相变温 度(Transition temperature)，该多肽在水溶液中为高度可溶，聚合物链保持无序结构，且相当伸展。相反，当温度高于该温度时，该含水的多肽链结构就瓦解， 并开始聚集，形成一个富含 ELPs的聚集物，由于ELPs具有这种
7、特殊性质，已 广泛应用于蛋白质纯化过程。故本课题选用ELPs作为融合标签进行抗菌肽的融合表达。近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆 菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生 内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。将重组后的质粒转入酵母细胞中表 达，若表达成功，抗菌肽可用于饲料添加剂，并且适合各种动物的饲养。本课题研 究抗菌肽在养殖渔业中的应用，抗菌肽可替代抗生素，对绿色养殖渔业的发展具有 重要作用。:、申请理由（包括自身/团队具备的知识、条件、特长、兴趣、前期准备等）李夏兰教师实验室，近几年从事生物饲料的研究，重点研究阿魏酸酯
8、酶在饲 料中的应用，已完成省重点项目及正进行集美科技局的有关生物饲料课题，在生 物饲料的研制中积累了一定的经验。张光亚老师实验室已经成功表达出类弹性蛋 白多肽（即ELPS20-140）,同时成功将ELPs20f木聚糖酶酶连接在质粒上，表达 出有木聚糖酶活性的融合蛋白。本课题是将 ELPs2的抗菌肽基因连接，构建融合 蛋白酵母表达体系。本课题有扎实的前期研究基础。团队的三位成员绩点均处于班级前列，对于无机化学、分析化学、有机化学 都有较好的了解，具备一定的理论基础，对于相关实验课的学习也很用心，积累 了一定量的理论基础和实验经验，有较强的动手能力和领悟能力，优秀的团队合 作精神，对科研也有着浓厚
9、的兴趣。熊小凡及吴凯伦同学在中国科学院城市环境 研究所参与过微生物对土壤中污染物的降解的课题研究，了解并掌握了液相色谱 仪，旋转蒸发仪及离心机等仪器的操作，具备一定的实验基础。实验条件方面，学校实验室能提供电泳系统，PC敢，离心机，包温箱，紫外分光检测仪，液相色谱仪等硬件设备，为实验的顺利进行创造了良好条件。三、项目方案(计划、技术路线、人员分工等)(一)实验内容及计划从APDK据库和已发表的文献中筛选出作用于鱼致病菌的抗菌肽基因，并将 其与含有ELPs的表达质粒融合，构建表达载体。将构建的表达载体导入酵母细胞 中，诱导融合蛋白表达。将融合蛋白分离纯化，并进行抑菌活性检测。融合蛋白 诱导表达后
10、的酵母细胞直接进行鱼饲喂实验，检测抗菌肽在活体鱼中的抑菌和抗 病效果。同时对融合蛋白表达、分离纯化等过程进行优化。(二)实验前期准备搜集资料，寻找合适的抗菌肽基因，掌握基因操作和蛋白质纯化的基本步骤。(三)具体人员分工(1)人工合成抗菌肽基因，构建表达融合蛋白载体；将构建的表达载体导入酵 母细胞，诱导融合蛋白表达：熊小凡，李小坤，汪诗维，吴凯伦；(2)融合蛋白分离纯化：熊小凡，李小坤；(3)纯化后的融合蛋白进行抑菌活性检测和鱼饲喂实验：吴凯伦，李小坤；(4)对融合蛋白表达、分离纯化等过程进行优化：汪诗维，吴凯伦。四、项目特色与创新点抗菌肽是生物抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一类小分子多肽，
11、与类 弹性蛋白多肽融合表达可提高抗菌肽的生产效率，降低成本，避免抗菌肽在表达 时对宿主菌的杀伤作用。同时，与传统的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、抗 菌谱广、热稳定性好、抗菌机理独特等优点。可替代抗生素在养渔业上的使用， 对提高所饲养的鱼类品质，推动绿色养鱼业的发展有着非常重要的意义。五、项目进度安排(1) 2013年3月-6月：抗菌肽基因的筛选；(2) 2013年6月-10月：表达载体的构建和融合表达；(3) 2013年10月-12月：融合蛋白的分离纯化及其过程的优化；(4) 2014年1月-9月：融合蛋白表达效果的检测(抗菌免疫和鱼养殖实验)六、项目经费使用计划(要求说明项目经费)(1)
12、实验材料：约7000元；(2) 资料费：约1000元；(3) 差旅费：约1000元；(4) 调研费：约1000元。七、项目完成预期成果(论文级别、专利、设计、产品、服务；创新实践项目需说明公司规模、营业额等)预期效果：成功表达融合蛋白，开发新型无污染、无残留的抗生素替代 品，解决当前渔业养殖中致病菌的感染，降低养殖鱼类的死亡率。同时 减少抗生素的使用，解决耐药性菌株的产生。预期论文级别：中文核心期刊1篇。预期经济效益：提高蛋白产量，减少蛋白纯化成本，在少用抗生素的前提 下，提高养殖鱼类成活率5%是否有专利？产品，应用证明？纯论文，基本上不提倡。指导教师意见：签 名：年月日学院意见：签名盖章：年月日学校意见：经校学生科技创新指导委员会评选，该项目定为:口 国家级口 福建省级口 校级签名盖章：年月日
