1、狼肠道菌群生态及犬科线粒体基因组比较和系统发育作为现存食肉目动物中分布最为广泛的类群, 犬科动物与人类生活有着千丝万缕的联系。在对犬科动物的研究过程中, 消化生理学领域的研究具有举足轻重的地位 , 其中有关消化道菌群生态的研究近年成为学术界的热点话题。尽管目前对家犬肠道菌群的研究已经比较深入, 但是狼的消化道菌群目前仍是个未知数。为了解狼的肠道菌群组成和多样性特征, 本文第一部分通过构建菌群 16S rRNA基因文库和进行系统发育分析 , 对采集自中国内蒙古自治区达赉湖自然保护区附近的 3 只健康成年狼的粪便菌群结构进行了分析。我们将 3 只狼的粪便样品分别构建 16S rRNA 基因文库 ,
2、 从中随机挑取 550个克隆进行检测 , 共得到 307 个不同的非嵌合体的细菌16S rRNA基因序列。根据97%的序列相似性 , 这些序列可划分为65 个临时分类单元 (OTU), 其中有 17 个OTU(代表着 98 个克隆的 16S rRNA基因序列 , 占克隆总数的 31.9%)与 GenBank和RDP数据库中现有序列的相似度小于98%,为未分类、未鉴定的细菌。系统发育分析表明 , 狼粪便菌群共有5 个细菌门组成 , 按照多样性高低依次是：Firmicutes(60% of totalOTUs), Bacteroidetes(16.9%),Proteobacteria(9.2%),
3、Fusobacteria(9.2%) 和 Actinobacteria(4.6%) 。Clostridiales是狼粪便菌群中最大的细菌目, 占据了 OTU总数的 53.8%。这一细菌目共由 5 个科组成 , 其中 Lachnospiraceae 是丰富度最高的一个科 ,其余四个科依次是： Ruminococcaceae, Clostridiaceae, Peptococcaceae和Peptostreptococcaceae。通过将本文研究结果与人类和家犬等其它哺乳动物肠道菌群结构进行比较发现, 狼粪便菌群结构与其它哺乳动物基本相同, 狼和家犬在 Actinobacteria门和 Fusob
4、acteriales门的细菌组成和数量上存在较大差别。线粒体基因组是比较基因组学研究的理想工具。家犬(Canis lupusfamiliaris)的线粒体全基因组测序于1997 年完成 , 至今已测序的犬科动物有四种：家犬、狼 (Canis lupus)、郊狼 (Canis latrans)和赤狐 (Vulpes Vulpes)。本课题组于 2008 年对分布于青海省的西藏狼(Canis lupus laniger)的线粒体基因组进行了测序。然而, 中国分布的其他种群的狼和其他犬科动物的线粒体基因组数据未见报道。因此 , 本文第二部分内容是应用Long-PCR和引物步移法 , 结合克隆测序法
5、,对中国分布的豺、貉和内蒙古地区分布的狼的线粒体基因组进行测序, 同时通过与已报道的犬科动物线粒体基因组进行比对分析, 探讨犬科动物线粒体基因组组成和结构的异同 , 从而总结出犬科动物线粒体基因组的结构特点。经测序 , 蒙古狼、豺和貉线粒体基因组全长分别是16709 bp 、 16672 bp 和 16713 bp, 三种犬科动物线粒体基因组均包含13 个蛋白质编码基因、 22 个 tRNA基因、 2 个 rRNA基因和 1 个非编码区。序列碱基的组成存在明显的A-T 偏好性。 tRNA基因中除 tRNA-Ser (AGY) 缺少双氢尿嘧啶 (DHU)臂以外 , 其余均能折叠成典型的三叶草二级
6、结构。在编码蛋白质基因的所有密码子中, 以编码亮氨酸 (Leu) 的其中一个密码子(CTA)和编码异亮氨酸 (Ile)的三个密码子 (ATT, ATC, ATA) 使用频率最高。大多数密码子的使用犬科各种动物高度一致, 蒙古狼和西藏狼的某些起始和终止密码子与其他犬科动物存在差别。通过对 4 个属 8 个种 ( 其中包括狼的三个亚种) 犬科动物的线粒体基因组的碱基组成和基因结构进行比较发现, 犬科动物线粒体基因组序列大部分区域高度一致 , 序列差异主要存在于非编码区的两翼区域(ETAS区和 CSB区) 。序列长度的差异主要由非编码区重复序列(RS-3) 重复次数的差异所致。通过对犬科动物之间碱基
7、替代情况进行分析发现, 不同种犬科动物的同一功能部位碱基替代速率较为一致, 同种犬科动物的不同功能基因的碱基替代率差异较大。 13 种蛋白质编码基因的碱基替代率也有明显不同, 其中以 L 链编码的 ND6基因的碱基替代率与其他蛋白质编码基因的差异最为显著。犬科动物线粒体基因组各功能部位中以tRNA基因的碱基替代率最低 , 说明tRNA基因在进化过程中高度保守。犬科动物系统发育地位的探讨在食肉目进化生物学研究中占有重要的地位。已有学者基于形态学和某些分子生物学数据进行过相关的分析, 但由于测序方法的限制和数据库中基因序列的缺乏, 未见基于线粒体基因组全序列的犬科动物分子进化的研究。作为本文研究的
8、第三部分内容, 我们在对蒙古狼、豺、貉线粒体基因组测序以后 , 应用所测得的蒙古狼和早期测得的西藏狼的线粒体基因组序列结合数据库中现有狼的亚种的数据, 对这两个地区狼的系统发育地位进行定位。同时利用测得数据结合GenBnak中已有线粒体基因组全序列的数据, 进行了犬科和犬型亚目的系统发育重建。基于 12SrRNA+16SrRNA+H链上的 12 个蛋白质编码基因的联合数据的系统发育分析表明, 在已报道的狼亚种数据中, 西藏狼的分化时间最早 , 其次为阿拉伯狼 (Canis lupus arabs),蒙古狼与欧亚狼 (Canislupus lupus)的系统发育地位最为接近。对犬型亚目系统发育分析发现, 犬型亚目可明显划为Cynoidea 和 Arctoidea两大类群。犬科的 4 个属 ( 犬属、豺属、狐属、貉属 ) 可分为 3 个进化地位平等的分支 , 进化时间估算貉属最先从犬科中分化出来。最大简约法、最大似然法和贝叶斯法的推断结果均验证了除郊狼以外的其他犬属动物的单源性。 拓扑结构所显示的狼和家犬的分化地位暗示着应将家犬作为狼的亚种进行划分。通过碱基替代率估算的家犬与狼的分化时间大约为1.56 1.92 百万年以前。
