1、犬 MDCK细胞 Irgm4 、5、6 基因敲除及其抗弓形虫生长作用弓形虫（ Toxoplasma gondii ）为专性细胞内寄生原虫可以感染包括人类在内的所有温血动物 , 呈全球性分布。弓形虫病作为人兽共患病主要通过食用含有活组织包囊的肉类 , 或摄入含有卵囊的食物或水而被感染。近年来 , 弓形虫病在养殖业中传播广泛, 尤其是猪 , 可造成妊娠母猪流产或产死胎 , 严重危害公共健康及畜牧业的发展, 而目前仍无有效预防弓形虫病的措施。因此 , 寻找理想的、有效的抑制弓形虫感染的方法已迫在眉睫。目前研究表明 , 在小鼠抗弓形虫感染的细胞免疫中, 干扰素能够诱导大量内源性天然免疫蛋白的表达并发挥
2、抵抗弓形虫感染的作用, 其中包含免疫相关GTP酶（ Immunity-related GTPase,IRG）和鸟苷酸结合蛋白（ GBPs）。IRGs 在结构和功能上分为 GMS（免疫相关 GTP酶家族 M）蛋白和 GKS（免疫相关 GTP酶家族 K）蛋白 ,GMS类 IRG（Irgm1 、Irgm2 、Irgm3 ）通过 missing-self的原理 , “引导”GKS类 IRG（ Irga6 、Irgb6 、 Irgb10 等）募集到纳虫空泡膜（Parasitophorousvacuole membrane,PVM）表面 , 并引起 GBPs的聚集 , 形成“攻膜复合体结构”,进而使得 P
3、VM发生囊泡化 , 暴露出其内的弓形虫 , 使得弓形虫被宿主细胞内的天然免疫分子识别 , 继而杀灭弓形虫。而在人类细胞中 ,IRGM蛋白可以通过自噬系统对入侵的内源性病原体进行杀伤。但研究表明人类细胞中GBPs不能被募集到 PVM表面发挥抗寄生虫作用 ,由此推测是否在进化过程中,GBPs在抗弓形虫感染免疫过程中功能消减。从进化角度分析犬的亲缘关系与人较近, 那么是否与小鼠相比犬中抗弓形虫感染的免疫机制与人的更为接近呢?因此本研究首先利用慢病毒包装的方法检测IRGS与 GBPs蛋白在野生型细胞的定位检测情况。 通过与小鼠 Irgm1 、Irgm2 、Irgm3 序列比对分析找到犬源Irgm4,I
4、rgm5,Irgm6蛋白 , 并设计特异性正向和反向 guide RNA（gRNA）, 利用 CRISPR/Cas9基因敲除技术对犬MDCK细胞中的 Irgm4,Irgm5,Irgm6 进行逐一敲除 , 并采用 PCR扩增及测序的方法进行验证 ,建立 Irgm4/5/6-/-基因敲除细胞系。其次在 IFN- 诱导和未诱导的情况下, 比较分析野生型犬肾细胞（MDCK）、Irgm4/5/6-/-基因敲除细胞系及Irgm4/5/6 基因补回细胞中弓形虫生长状况。研究结果显示, 在 IFN- 未诱导的情况下 , 弓形虫生长差异不显著 ; 而在 IFN- 诱导的情况下 ,Irgm4/5/6-/-基因敲除
5、细胞与野生型 MDCK细胞相比弓形虫生长速度显著升高, 表明犬细胞中 Irgms 为IFN- 诱导型基因并发挥抗弓形虫生长的作用。第三 , 为了进一步探究犬细胞中Irgms 抑制弓形虫生长的协同作用蛋白, 利用激光共聚焦的方法检测相关蛋白与弓形虫PVM的定位情况 , 研究表明 Irgb11与 Irgb12 被募集到弓形虫 PVM的表面发挥抗弓形虫的作用 , 其中 Irgb12 发挥主导作用 , 而 GBP1和 GBP5并没有被募集到 PVM的表面 , 说明在犬细胞中 GBPs并不能通过破坏 PVM的方式抑制弓形虫生长这与人源 GBPs功能相似。本研究首次对犬 MDCK细胞中的 Irgm4,Irgm5,Irgm6 进行逐一敲除 , 验证了Irgm4/5/6-/-基因敲除细胞抗弓形虫生长作用。结果表明在犬 MDCK细胞中 , 利用 CRISPR/Cas9基因敲除技术验证了经IFN-诱导下 Irgm4 、Irgm5 、Irgm6 具有发挥抑制弓形虫生长的功能,Irgms 蛋白能诱导 Irgbs蛋白募集到弓形虫PVM的表面形成类似“攻膜复合体”的结构破坏PVM从而发挥抗弓形虫生长的作用。本研究为今后深入研究宿主抗弓形虫感染的天然免疫机制奠定基础。
