1、 矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞 MMP作者：王海涛，刘昊，颜京霞，田艳霞，江小华，高俊玲【关键词】肺间质纤维化Expressinfatrixetallprteinase2and9inpulnaryfibrblastsfsilitifibrsisratdel 【Abstrat 】AI作者：王海涛，刘昊，颜京霞，田艳霞，江小华，高俊玲【关键词】 肺间质纤维化Expressin f atrix etallprteinase2 and 9 in pulnary fibrblasts f siliti fibrsis rat del【Abstrat】 AI: T study the expressin
2、f P2 and P9 in fibrblasts f rat siliti fibrsis del and its signifiane. ETHDS: Fifty pathgenfree istar rats ere randly divided int experiental grup and ntrl grup. Experiental grup as instillated ith Si2, hile ntrl grup ith nral saline. Pulnary interstitial fibrblasts ere islated n day 1, 3, 7, 14 and
3、 28 after Si2 expsure. The prtein and RNA expressin f P2 as evaluated by iunytheistry and RTPR. RESULTS: The P2 prtein expressin in fibrblasts inreased n day 1 after Si2 expsure and reahed 3.887 ties（t=23.667 ，P 0.001） that f ntrl grup n day 7. The expressin f P9 prtein als inreased n day 1 after Si
4、2 expsure and reahed 3.103 ties that f ntrl grup（t=11.399, P 0.001）n day 7. The RNA expressin f P2 and P9 as enhaned in fibrblasts at 24 h after Si2 instillatin. NLUSIN: The expressin f P2 and P9 in fibrblasts is upregulated in siliti fibrsis del.【Keyrds】 atrix etallprteinase; fibrblast ells; pulnar
5、y fibrsis; siliti fibrsis【摘要】 目的 :探讨肺间质成纤维细胞 P2 和 P9 在 Si2 致肺纤维化中的表达及意义 . 方法: 清洁级 istar 大鼠 50 只，随机分为对照组和实验组，实验组气管内注射 Si2 悬液，对照组代以等剂量生理盐水. 注射后 1，3 ，7，14 和 28 d 分离和提取肺间质成纤维细胞，应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPR）方法，观察其 P2，P9 蛋白及其 RNA 的. 结果:Si2 作用后 1 d 成纤维细胞 P2 表达增高，7 d 达高峰，为对照组的 3.887 倍（t=23.667，P 0.001） ；P9 在 Si
6、2 作用后 1 d 表达增高，7 d 达对照组的 3.103 倍（t=11.399 ，P 0.001） ；P2 RNA 和 P9 RNA 的转录从 Si2 作用后 1 d 就开始升高. 结论:受 Si2 刺激后，肺间质成纤维细胞上调 P2 和 P9 的表达，损伤肺泡基底膜，启动肺纤维化的.【关键词】 基质金属蛋白酶；肺间质成纤维细胞；肺间质纤维化；矽肺 0 引言基质金属蛋白酶及其组织抑制物（atrix etallprteinase and tissue inhibitr f atrix etallprteinase, P/TIP）是肺纤维化效应细胞分泌的生物活性分子，在细胞外基质 (extra
7、ellular atrix, E)的合成和降解中意义. 在 P 家族中，P2 和 P9 的特异性底物主要是型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的成分. 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化过程的关键事件1. 在 Si2所致肺纤维化过程中的不同阶段分离肺成纤维细胞（lung fibrblast,LFb） ，应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPR）对 P2 和 P9 蛋白及其 RNA 探讨如下.1 材料和方法1 1 材料健康雄性 SD 大鼠，体质量（18040 ）g，由华北煤炭医学院医学实验动物中心 . Si2 粉尘（预防医学科学院劳卫所） ；小鼠抗波形蛋白（vientin） Ab 及免疫组
8、化染色 SAB 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司） ；羊抗 P2 和羊抗 P9 多克隆抗体（Santa ruz 产品） ；免疫组化 SP 试剂盒（北京中生物技术有限公司） ；Trizl 试剂盒（ Gib 公司产品） ；逆转录反应试剂盒（Takara 公司产品） ；PR 扩增试剂盒和 DNA 梯度 arker（Sangn 公司） ；引物由 Sangn公司合成，PAGE 纯化. P2 引物序列为 5TA TT TGT AG A TTT GG3（sense） ，5AG AT TTG GTT T AA TT3（antisense） ，扩增片段长度为 303 bp. P9 引物序列为 5AAA TGT
9、 GGG TGT AA AG G3 （sense ） ，5TT A GG TTG TGG AAA T3（antisense） ，扩增片段长度为303 bp. 内参照采用 GAPDH，引物序列为 5TT TG AGT GG AGT GAT GG3 （sense ） ，5 TGG A AGT AA GG TGA GA3（antisense ） ，扩增片段长度为 389 bp.1 2 方法大鼠 50 只，随机等分为实验组和对照组. 实验组大鼠乙醚麻醉后，采用经气管染 Si2 粉尘法复制矽肺模型2. Si2 粉尘悬液 50 g/L，生理盐水配制，每只大鼠 1 L. 对照组在相同条件下气管内注入生理盐水
10、 1 L. 染尘后 1，3，7，14，28 d 分别处死实验组和对照组各 5 只，无菌操作取肺. 采用酶消化法组织块贴壁培养法分离和培养细胞. 用 SAB 法检测细胞的波形蛋白（vientin）的表达，以鉴定分离培养的细胞为肺间质成纤维细胞.1 2 1 免疫细胞化学检测 P2 和 P9 将第 4 代 LFb 接种于载玻片上，贴壁后，血清饥饿使其同步化，SP 试剂盒说明，作细胞爬片的免疫细胞化学染色. 羊抗鼠 P2 一抗和羊抗鼠 P9一抗 1150 稀释. DAB 显色. PBS 代替一抗作阴性对照. 染色结果经 ti ed 6.0 数码医学图像分析系统（北航）作图像分析，胞质中的棕褐色颗粒为表
11、达阳性，表达强度用积分吸光度（A）表示. 1 22RTPR 检测 P2 和 P9 RNATrizl 试剂盒说明提取细胞总 RNA. 逆转录参照说明书，反应条件 42 15 in，95 2 in；PR 扩增反应参照说明书，反应条件 94，45 s；58，45 s；72，80 s；30 个循环. 扩增产物 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳. 电泳条带采用凝胶成像系统做积分吸光度（A 值）测定，以实验组和对照组 P2, P9 与 GAPDH 的 A 比值的表示 P2 RNA 的表达量 .统计学： 数据以 xs 表示，用 SPSS 11.0 统计软件包组间 t 检验，方差不齐时用 t检验.2 结果2 1P
12、2 和 P9 的表达矽肺模型组大鼠 LFb P2 和 P9 表达比对照组，7 d 为表达高峰(Tab 1, Fig 1).表 1 肺间质成纤维细胞 P2, P9 蛋白及 RNA 表达的（略）2 2P2 和 P9 RNA 的模型组 LFb P2 和 P9 RNA 表达与对照组增高(Tab 1).3长期吸入 Si2 粉尘引起的矽肺，其主要病理是矽结节和间质纤维化, 但其发病机制尚未完全阐明. ,吸入 Si2 粉尘后，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等分泌多种细胞因子，肺泡炎的发展，引起性肺间质纤维化. 纤维化的是细胞外基质合成与降解不平衡的结果. 近年来，细胞外基质降解系统是基质金属蛋白酶及其组织抑制因子
13、功能紊乱，在纤维化疾病中愈来愈受到. 表明，基质金属蛋白酶在细胞外基质的降解与重塑的病理生理发展过程中起关键性作用. P2和 P9 的特异性底物是型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的成分. 由致病因素引起的 P2,P9高表达在破坏肺泡上皮细胞基底膜继而纤维母细胞侵入肺泡腔引起肺纤维化中起作用3. 动物实验和临床调查均表明，在肺纤维化中有 P2 和 P9 的高表达4.本结果显示,注入 Si2 粉尘后 1 d P2 蛋白表达即升高，对照组的 1.245 倍（t=2.660 ，P 0.05） ，7 d 高峰，为对照组的 3.887 倍（t=23.667 ，P 0.01） ，28 d 仍高于对照组（t=5.
14、621，P 0.01）. 其 RNA 表达亦增高. P9 及其 RNA 表达和对照组在 1，3 ，7 d 升高. 提示在肺间质纤维化早中期，肺间质成纤维细胞是 P2 和 P9. 肺间质成纤维细胞高表达 P2 和 P9，启动了介于炎症细胞之间、炎症细胞与肺组织12下一页 【 结构细胞之间细胞与细胞外基质之间持续性发展的“rss talking”5. 表明，在肺纤维化模型中肺间质成纤维细胞可以高表达 P2，亦有学者对肺纤维化患者的肺成纤维细胞体外培养，亦其增高的 P9 表达6 . 可见，肺间质成纤维细胞不单纯是肺纤维化的效应细胞. 注入 Si2 粉尘后，肺间质成纤维细胞表达 P2 和 P9，肺泡基
15、底膜的损伤，从而启动肺纤维化.【参考文献】1 Lasky JA, rtiz LA. Antifibrti therapy fr the treatent f pulnary fibrsisJ. A J ed Si, 2001;322(4):213-221.2 邹昌淇,杜庆成,周培宏. 联合用药治疗大鼠早期矽肺的疗效观察J.劳动卫生职业病杂志,2001;19(1):7-9.Zu Q, Du Q, Zhu PH. Study n therapeuti effet f bined use f antisilisis drugs n early experiental f ratsJ . hin J
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17、titial pneuniasJ. A J Respir rit are ed, 2000;162(5):1949-1956.5 Sheppard D. Pulnary fibrsis: A ellular verreatin r a failure f uniatin?J. J lin Invest, 2001;107(12):1501-1502.6 Ras , ntan , GariaAlvarez J, et al. Fibrblast fr idipathi pulnary fibrsis and nral lungs differ in grth rate apptsis and tissue inhibitr f etallprteinases expressinJ. A J Respir ell l Bil, 2001;24(5):591-598.上一页12
