1、附录 B外源性DNA残留量测定法第一法 DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。（3）2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20备用。（4）3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10
2、ml中。（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调pH值至8.0。（6）5.0mol/L氯化钠溶液（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） 用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH至8.0。（8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液 用盐酸调pH至7.2。（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液 2.5 ml， 加灭菌水至10ml。（10）TE缓冲液（pH8.0） 量取1mol/L Tri
3、s溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。（11）1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度， 摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20备用。（12）DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50l，加TE缓冲液至10ml。用于探针标记和阳性对照的DNA制备 用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考分子克隆实验指南（美J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学
4、出版社，2002）或精编分子生物学实验指南（美F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml含108个细胞细菌。取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400l混匀，37作用1224小时后，加入饱和酚溶液450l，剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450l重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯甲烷450l，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40l，充分混合，再加入-20以下的无水乙醇1ml，充
5、分混合，-20以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量-2070乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度：应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.82.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.21.0）。用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。阳性对照品的DNA浓度根据下式计算DNA浓度（ng/l）= 50A2
6、60阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20以下保存，长期使用。探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。测定法 （1）蛋白酶 K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37保温4小时以上，以保证酶切反应完全。加样量2蛋白酶K溶液蛋白酶缓冲液3牛血清白蛋白溶液加水至终体积供试品100l1l1l200lD1100l1l1l适量200lD2100l1l1l适量200lD3100l1l1l适量200l阴性100l1l1l适量200l 注意事项：供试品的稀释根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100l 含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用DN
7、A稀释液将供试品稀释至每100l 含1/10人份剂量或每100l含1/100人份剂量。D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA 1000ng。然后依次10倍稀释成10ng/100l (D1)、1ng/100l (D2)、100pg/100l (D3)三个稀释度；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求（100pg/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg /100l (D1)、10pg /100l (D2)、1pg/100l (D3)三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进行蛋白酶 K预处理的TE缓冲液。当
8、供试品1/100人份剂量大于100l时，终体积也随之增大，一般终体积为供试品体积的一倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶 K的活性。2蛋白酶 K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1/20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1/10。加入3牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质与供试品（通常为蛋白质）的酶切条件保持一致；如供试品为其他物质，则应改用其他相应物质。若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品DNA（阳性对照、阴性对照也应再次提取DNA，与供试品溶液平行）。（2）点膜 用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供
9、试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒。用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80真空干烤1小时以上。（3）杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色梯度；阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。第二法 荧光染色法（新增）PicoGree
10、n是一种高灵敏度双链DNA荧光染料。该染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480 nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520 nm处进行检测，在一定的DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与DNA浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的DNA残留量。试剂 （1）20TE缓冲液（200 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，pH7.5） 加灭菌水配置成1TE。（2） PicoGreen染料 用1TE缓冲液将PicoGreen染料稀释200倍，应现用现配，并注意避光。（3） DNA标准品 取DNA标准品适量溶于TE中，制成100 g/ml DNA标
11、准品，于-20条件下保存。标准品溶液的制备 用1TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80 ng/ml的标准品溶液。测定法 精密量取标准品溶液和供试品溶液各400ml于1.5ml 离心管中，分别加入稀释后的PicoGreen染料400 ml，混匀后，避光室温放置5 分钟。取250ml上述反应液于96孔板黑色酶标板中，并做3个复孔。用荧光酶标仪于激发波长480nm、发射波长520nm处测定荧光强度。以1TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。 用标准品溶液的浓度（ng/
12、ml）对其相应的荧光强度作直线回归（相关系数应不低于？），将供试品溶液的荧光强度代入回归方程，求出供试品的残余DNA含量（ng/ml）。 注意事项 （1）该法DNA检出限为0.3 ng/ml。DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好，因此供试品DNA含量在该范围内可定量测定；当DNA含量低于1.25 ng/mL时应为限量测定，表示为小于1.25 ng/mL。（2）若供试品对回收率和精密度无干扰，则可直接测定。（3）若精密度好，但供试品轻微干扰回收率时，无需对供试品DNA做进一步纯化，可直接测定，但每次测定均应增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正。（4）若供试品严重干扰回收率和精密度时，应采用适宜方法（参见本项目第一法）纯化DNA以排除干扰，直至精密度和回收率试验均符合要求。需要纯化DNA后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正。
