1、DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。二、实验原理：DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3
2、 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位
3、点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。三、实验方法及步骤： 1、复苏并培养细胞，当细胞长至一定程度后，收细胞沉淀并提取其DNA。 2、使用EZ DNA METHYLATION-GOL
4、DTM KIT 试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，详见附录1。 3、将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，详见附录2（BSP）。 4、切胶回收。 5、TA-cloning和转化。 6、涂平板进行蓝白斑筛选。 7、当菌落长至一定程度后，挑选白色菌落进行菌落PCR（体系同BSP）。 8、挑选上一步中跑胶出现条带的白色菌落先将其加入约3ml的不含抗性的LB液体培养基中摇过夜，后取其1ml送去测序。其余的菌液取500ml加入500ml 50%的甘油冻入-80冰箱。 9、测序结果分析（详见附录3）。四、试剂配制： 1、CT Conversion Reagent：（1）、将900 l 水
5、, 300 l 的M-Dilution Buffer和 50 l M-Dissolving Buffer加入一管的 CT Conversion Reagent。（2）、在室温下震荡或颠倒约10分钟将其混匀。注意: CT Conversion Reagent中常有少量的不溶试剂，这很正常。每一管 CT Conversion Reagent 可以处理10个不同的DNA样品。保存: CT Conversion Reagent 对光敏感, 故要注意避光。为了得到最好的结果, CT Conversion Reagent最好现配现用。如果用不完, CT Conversion Reagent 溶液可以室温过
6、夜、 4C保存一周或 -20C保存一个月。保存的 CT Conversion Reagent溶液必须现将其热至37C, 震荡后再使用。 2、M-Wash Buffer：将 24 ml100% 的乙醇加入 6 ml M-Wash Buffer 浓缩液中。五、注意事项：1、亚硫酸氢盐修饰的DNA样品的量要在500pg到2ug之间。 2、BSP很容易污染出现阴性条带，故此步骤要注意操作，避免污染。3、Taq酶是热启动酶。 4、感受态细胞取出后要马上放在冰上解冻，并在刚解冻时马上使用其转化效率最高。感受态细胞要注意不要反复吹打。 5、步骤6中要使用KANA或Amp抗性的LB平板，在用菌液涂板前要先在每
7、个平板上涂上500mM的IPTG约8ul和40mg/ml的x-gal约40ul，并在37预热。附录1：1、在PCR单管中加入130ul的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品（如样品少于20ul，用水补齐）。2、PCR(98 10min 64 60min 64 60min 64 30min 4)。3、将600ul的M-Binding Buffer加入Zymo-Spin IC Column中，并将其放入收集管中。4、将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin IC Column中，关上盖子并颠倒混匀。5、离心（最高速）30s，弃收
8、集管中的液体。6、加入100ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。7、加入200ul的M-Desulphonation Buffer，在室温下（2030）静置1520分钟，离心（最高速）30s。8、加入200ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。重复一次。9、将Zymo-Spin IC Column置入1.5 ml离心管中，加入10ul的M-Elution Buffer（尽量靠近柱子中心），离心（最高速）30s。产物放入-20保存。附录2:MSP-S体系：DNA 4ul10*PCR buffer 2.5uldNTPS 1.5ulp16-s-f （primer
9、，各为 1ulp16-s-r 10uM) 1ulTaq 0.2ulddH2O 14.8ul反应条件：95 10min 95 1 min 58 40s 72 1min 72 10min 4Step 1 1cycle step2 40 cycle step3 1 cycle 附录3：举例：上图中P16 exon1是完全未甲基化的对照序列，可见其所有未甲基化的C都转化为T。其下五个DNA序列为本次测序后回来的序列，它们分别是SCID22-3B-1-tumor细胞的加puer-tea组、加5-aza-dc组和空白对照组。正常的SCID22-3B-1-tumor细胞其p16基因由于其启动子CpG岛甲基化是甲基化沉默的，而加puer-tea和5-aza-dc会去甲基化。由上图可见空白对照组中红色的C为仍然甲基化的C,这些红色的C就是p16基因CpG岛甲基化位点。而其同一列中黑色的T为去甲基化而转化为T 的C。
