1、如何改善RNA提取质量发布日期:2008-10-23热门指数:3238 1.在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定
2、要够薄（0.5 cm），这样RNAlater才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。2.使用正确的细胞或组织储存条件在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。RNAlater使样品储存更为便利。储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20C。有关RNAlater的更多信息请参考 RNA Isolation Aid 预处理裂解液可去除这些难以处理的成
3、分。5.选择最好的RNA分离方法现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如RNAqueous? 或RNAqueous-4PCR Kit。因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）的样品，就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法，如ToTALLY RNA?。更多的信息请参考 。更多方法选择，请参考 http:/ Kit的实验流程中包含了DNase处理的步骤，并提供了必需的试剂（DNA酶I）。DNA-free? DNase treatment & Removal Reage
4、nts 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I，优化的反应缓冲液，和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法，无需使用有机溶剂和热处理。7.减少环境RNase的暴露为了得到完整的、高品质RNA，在整个RNA制备过程中，当RNA离开强蛋白变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 来
5、处理过。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。8.正确的沉淀纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀（加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇，-20C放置25分钟以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide）的方法。当RNA用于RT-PCR分析时，线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂，因为它们都不含DNA污染。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来
6、核酸污染，有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后，注意避免RNA沉淀过分干燥，因为这可能导致很难重新溶解。9.重悬许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求：无RNase污染、较低的pH值（pH 6-7）、含有螯合剂，以保护RNA不受带入的RNase的降解。（THE RNA Storage Solution能满足以上所有标准。）为了帮助溶解，RNA沉淀可置于重悬溶液中在65C孵育5分钟，并不时轻摇以帮助溶解。10.储存如果只是短期储存，重悬的RNA应放置于-20C；如果是长期储存的话，就应该放置于-80C。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80C，但保存于醋酸铵/乙醇溶液中的RNA沉淀则更加稳定。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA，并预防偶然的RNase污染。
