1、本 科 生 毕 业 论 文谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像 纳米探针的制备研究 姓 名： 杨 娜 学 号： 1110371042 学 院： 医学影像学院 专 业： 生物医学工程 年 级： 2011 级 指导教师： 李菁菁 职 称： 助理研究员 2015 年 6 月 徐州徐州医学院生物医学工程专业本科毕业设计任务书学院 医学影像学院 专业年级 2011 级生物医学工程 学生姓名 杨娜 任务下达日期： 年 月 日毕业设计日期： 年 月 日至 年 月 日毕业设计题目：谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的制备研究毕业设计主要内容和要求：1完成四氧化三铁纳米粒子（Fe 3O4） 、氧化钆（PEG-Gd
2、 2O3）及胱胺的制备，并对其性能进行表征，研究其特性。2. 谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的组装，即在偶联剂存在下，将 Fe3O4 与 PEG-Gd2O3 通过胱胺结合形成 Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针，并通过控制单一变量的方法对纳米探针中的 Fe3O4 和 PEG-Gd2O3 浓度进行优化，确定最佳信噪比的用量。3. 通过纳米探针对 786-0 肾癌细胞的生长抑制作用评估其生物相容性。院长签字： 指导教师签字：徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文指导教师评阅书指导教师评语（基础理论及基本技能的掌握；独立解决实际问题的能力；研究内容的理论依据和技术方法；取得的主要成果及创新
3、点；工作态度及工作量；总体评价及建议成绩；存在问题；是否同意答辩等）：成 绩： 指导教师签字：年 月 日徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文评阅教师评阅书评阅教师评语（选题的意义；基础理论及基本技能的掌握；综合运用所学知识解决实际问题的能力；工作量的大小；取得的主要成果及创新点；写作的规范程度；总体评价及建议成绩；存在问题；是否同意答辩等）：成 绩： 评阅教师签字：年 月 日徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文答辩及综合成绩答 辩 情 况回 答 问 题提 出 问 题 正 确基 本正 确有 一般 性错 误有 原则 性错 误没 有回 答答辩委员会评语及建议成绩：答辩委员会主任签字： 年 月 日
4、学院领导小组综合评定成绩：学院领导小组负责人： 年 月 日摘 要目前，恶性肿瘤是威胁人类健康的常见病、多发病。MRI 在神经系统、肌肉骨骼、心血管和肿瘤等疾病的诊断中具有独特的优势，然而如何设计制备新型可激活磁共振成像（MRI）分子探针用于肿瘤成像仍然研究较少，这对于提高肿瘤诊断的特异性具有十分重要的意义。研究表明，肿瘤组织较正常组织中谷胱甘肽（GSH）高表达。因此，本文设计了谷胱甘肽响应可用于肿瘤细胞的特异性成像的可激活磁共振分子成像探针。讨论了将阳性对比剂(PEG-Gd 2O3)及阴性对比剂（ SPIO: Superparamagnetic Iron Oxide）通过胱胺相连接制备成 GS
5、H 响应的可激活磁共振对比剂（Fe 3O4-SS-Gd2O3 纳米探针）的制备方法及其优化。当没有谷胱甘肽存在时，SPIO 产生的强磁场对 PEG-Gd2O3 的 MR 信号有淬灭作用，MR T1 信号变弱，当有谷胱甘肽存在时，纳米探针的双硫键被打开，MR T1 信号变强。与目前临床最常使用的 Gd-DTPA 相比，纳米对比剂具有弛豫率高、敏感性强、特异性高等优点。本文也通过 MTT 测试证明 Fe3O4-SS-Gd2O3 纳米探针具有良好的生物相容性。将不同浓度 Fe3O4-SS-Gd2O3 纳米探针与肾癌细胞 786-0 作用，当Gd 3+浓度低于0.2mM 时，细胞形态良好未发生明显改变
6、；MTT 测试表明，当Gd 3+浓度低于0.1mM 时，细胞的存活率均在 90%以上，当Gd 3+浓度高于 0.15mM 时，细胞存活率明显降低。关键词：谷胱甘肽； 可激活磁共振成像； 纳米对比剂； 磁共振成像分子探针ABSTRACTCurrently, cancer is a common and multiple disease which is a threat to human health. Magnetic resonance imaging (MRI) has unique advantages in diagnosis of diseases such as the nervo
7、us system, musculoskeletal, cardiovascular and tumor. However, the researches on how to design activatable MRI molecular probe which can be used for the specific tumor imaging is still scarce. The development of this kind of probes would improve the sensitivity of MRI for its role in the field of di
8、agnosis of tumor obviously.Studies have shown that glutathione(GSH)s content in tumor tissue is significantly higher compared with normal tissue. Therefore, in this thesis, GSH-response activatable MRI molecular probe was desgined for the specific MRI of tumor cells. The preparation and optimization
9、 of activated MRI probe (Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobe), which was formed by the combination of PEG-Gd2O3 and Fe3O4 with cysteamine as linker were discussed. In the absentance of GSH, the magnetic field generated by SPIO perturbs the relaxation process of PEG-Gd2O3. This phenomenon induces the quenching
10、of T1 signal. But in the presence of GSH, the disulfide bond of nanocomposite is opened, MR singal of T1 becomes brighter. Compared with Gd-DTPA, which is commonly used in clinical diagnosis, the nanoparticle-based MRI contrast agents not only have higher relaxationrate, but also have higher sensiti
11、vity and specific.Furthermore, with the MTT test, Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes displayed good biocompatibility. Renal carcinoma 786-0 cell were incubated with different concentrations of Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes. When the concentration of Gd3+ was below 0.2 mM, cell morphology were good. The results o
12、f MTT showed that when the concentration of Gd3+ was lower than 0.1 mM, cell viabilities were more than 90%, and when the concentration of Gd3+ was higher than 0.15mM, cell viabilities were decreased.Key words: Glutathione; Activatable MRI; nanoparticle-based contrast agent; MRI molecular probe目 录1
13、绪论 .11.1 研究背景 .11.2 课题的提出 .41.3 论文结构和各章节安排 .42 材料合成 .52.1 四氧化三铁（Fe 3O4）纳米粒子合成 .52.1.1 引言 .52.1.2 实验试剂及器材 .52.1.3 实验步骤 .62.1.4 透射电子显微镜（TEM：Transmission electron microscope）扫描 .62.1.5 ICP-MS 制样 .72.1.6 MR 扫描 .72.1.7 傅里叶变换红外光谱分析 .82.2 PEG-Gd2O3合成 .92.2.1 引言 .92.2.2 实验试剂及器材 .92.2.3 透析袋前处理 .102.2.4 实验步骤
14、.102.2.5 MR 扫描 .112.2.6 傅里叶变换红外光谱分析 .122.3 胱胺合成 .132.3.1 引言 .132.3.2 实验试剂及器材 .132.3.3 实验步骤 .142.4 讨论 .143 可激活 MRI 纳米探针 Fe3O4-SS-Gd2O3的制备 .153.1 Fe3O4-SS-Gd2O3的傅里叶变换红外光谱分析 .153.2 不同浓度四氧化三铁（Fe 3O4）纳米粒子对 MRI 信号的影响 .153.3 不同浓度氧化钆（PEG-Gd 2O3）对 MRI 信号的影响 .163.4 谷胱甘肽（GSH）对 T1弛豫率的影响 .173.5 不同浓度谷胱甘肽（GSH）的 MR
15、I 信号响应 .183.6 讨论 .194 可激活 MRI 纳米探针 Fe3O4-SS-Gd2O3的 MTT 测试 .204.1 实验试剂及器材 .204.2 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞培养 .214.2.1 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞复苏 .214.2.2 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞传代 .224.2.3 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞计数 .224.2.4 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞冻存 .224.3 786-0 肾癌细胞培养 .224.3.1 786-0 肾癌细胞复苏 .234.3.2 786-0 肾癌细胞传代 .234.3.3 786-0 肾癌细胞计数 .234.3.4
16、 786-0 肾癌细胞冻存 .244.4 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞、786-0 肾癌细胞种板 .244.5 MTT 测试 .254.5.1 786-0 肾癌细胞形态表征 .264.5.2 786-0 肾癌细胞存活率测定 .264.6 讨论 .275 总结与展望 .285.1 总结 .285.2 展望 .28参考文献 .30翻译 .33英文原文 .33中文译文 .40致 谢 .451 绪论1.1 研究背景近年来，肿瘤的发生越来越多，且发病年龄越来越年轻化。然而，肿瘤很难在早期得到及时诊断和治疗，因此，恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的常见病，多发病，早期特异性诊断可提高患者生存率，改善生活质
17、量 1。由于传统影像诊断方法主要针对实质性肿瘤，此时患者已经处于临床中晚期，故治疗效果差，预后较差。所以，恶性肿瘤仍然是威胁人类健康与寿命的一大关键因素。因此，在临床上找到一种有效的肿瘤检查方式与诊断方法并进行良恶性判定具有十分重要的意义。既往有大量的研究专注于寻找特异性的肿瘤血清标志物，应用于肿瘤的早期诊断 2。研究发现，肿瘤组织中谷胱甘肽（GSH ）含量明显高于肿瘤旁组织，在人乳腺癌细胞 MCF-7 中，谷胱甘肽的浓度为（6.29 士 0.67）nmol/10 6。吴琛珩等对人消化道肿瘤组织的检测结果也揭示，肿瘤组织内还原性谷胱甘肽和辅酶（GSH、NADPH）的含量显著高于相应的癌旁组织，
18、提示肿瘤细胞中确有GSH 的高表达 3。随着分子生物学和医学影像学的飞速发展，近年来产生了一门新兴的交叉学科- 分子影像学。分子影像学是指运用影像学的手段，在组织、细胞和亚细胞水平显示活体状态下某些特定分子的变化，对生物学行为进行定性和定量的研究，为疾病过程在体监测、基因治疗、在体示踪、药物在体疗效评测和功能分子在体活动规律研究提供新技术。分子影像学在疾病早期诊断、提供疾病发展重要信息和评价治疗效果方面具有诱人的潜能，具有无创、实时、在体、特异、精细显像等优点 4-6。所以，分子影像技术可望为疾病的研究和临床“早早期” 诊断、治疗提供基因分子水平信息，而在分子影像学成像技术中，靶向性和高亲和性
19、分子探针的制备起着关键作用 7-8。磁共振成像是利用生物体不同组织在磁共振过程中产生的具有不同特征的电磁波信号成像技术，是上世纪 80 年代以来医学影像学发展的最新成就之 9-10。磁共振成像技术也因为其无创伤性、无辐射损伤、非侵入性、并具有多序列、多参数（不同组织与磁共振有关的特征参数如质子密度、纵向弛豫时间、横向弛豫时间、弥散系数等都可以作为成像参数） 、任意平面成像、较高的密度分辨率等优点 11广泛的应用于临床，已经成为临床诊断中最常用的影像检查手段之一 12。但是随着医学技术的飞速的发展和人们生活水平的日益提高，常规的磁共振检查已经不能满足临床诊断的要求，人们对磁共振成像的特异性、精确性、敏感性提出了更高的要求。为了实现对微小病变及隐匿病变的早发现、早诊断、早治疗，学者纷纷投入到提高疾病诊断准确性的成像方法的研究。虽然单一的磁共振成像设备已经对脂肪、软组织等低密度组织具有的成像效果，但它仍然不可以实现对全身任意组织的扫描成像并提供有诊断价值的图像。通过磁共振和其他成像设备的
