1、1第一章 绪 论1.农药残留的定义农药残留(pesticide residues)是指由于农药的应用而残存于生物体、农产品和环境中的农药亲体及其具有毒理学意义的杂质、代谢转化产物和反应物等所有衍生物的总称。凡具有毒理学意义的这些农药杂质和降解产物不仅包含在农药残留的定义中，同样也包含在农药残留分析和管理的范畴内。2.农药残留的分类农药残留根据使用有机溶剂和常规提取方法能否从基质中提取出来，分为可提取残留(extractable residues)和不可提取残留(unextractable residues)。可提取残留是农药残留分析的对象。不可提取残留又分为结合残留(bound residue
2、s)和轭合残留(conjugated residues)。3.农药残留的来源：直接来源、间接来源4.初始残留量：在农药施用结束或暴露(包括转移) 停止时发生的农药残留程度称为初始残留量。残留半衰期：即农药初始残留量至降解一半所需的时间来表示。5.农药残留毒性：因摄入或长时间重复暴露农药残留而对人、畜以及有益生物产生急性中毒或慢性毒害，称农药残留毒性(pesticide residual toxicity)。6.构成突出残留毒性的农药：高毒农药；化学性质稳定、难以生物降解、脂溶性强、容易在生物体富集的农药；农药亲体或其杂质或代谢物具有三致性(致癌、致畸、致突变) 的农药。7. 最大残留限量 (M
3、RLs，maximum residue limits)。最大残留限量是指农畜产品中农药残留的法定最大允许量，其单位是 mgkg。8. 农药残留分析的目的和特点农药残留分析是应用现代分析技术对残存于各种食品、环境介质中微量、痕量以至超痕量水平的农药进行的定性、定量测定。主要作用和目的：研究农药施用后在农作物或环境介质中的代谢、降解和转归，制定农药残留限量标准、农药安全使用标准等，以满足政府管理机构对农药注册以及农药安全、合理使用的管理的需要；检测食品和饲料中农药残留的种类和水平，以确定其质量和安全性，并作为食品和饲料在国际国内贸易中品质评价和判断的标准和依据，满足政府管理机构对食品质量和安全的管
4、理的需要；检测环境介质(水、空气、土壤)和生态系生物构成的农药残留种类和水平，以了解环境质量和评价生态系统的安全性，满足环境监测与保护的管理的需要。农药残留分析是分析化学中最复杂的领域，其原因是以下几个特点所致：残留分析需分离和测定的物质是在 ng(10-9g)、pg(10 -12g)甚至 fg(10-15g)水平，一次成功的分析需要有对许多参数的正确理解。例如提取和净化方法的成功与否取决于残留分析人员对操作条件的正确选择和结合。样品使用农药历史的未知性和样品种类的多样性，造成了分析过程的复杂性。农药品种的不断增多，对农药多残留分析提出了越来越高的技术适应性要求。9.农药残留分析方法：单残留方
5、法(SRM，single residue methods)，定量测定样品中一种农药( 包括其具有毒理学意义的杂质或降解产物)残留的方法。这类方法在农药登记注册的残留试验、制定最大农药残留限量(MRL)或在其他特定目的的农药管理和研究中经常应用；多残留方法(MRM，multiresidue methods)，根据分析农药残留的种类不同，可分为选择性多残留方法 和多类多残留方法。前者分析同一类的多种农药残留，后者一次分析多类多种农药残留。多残留方法经常用于管理和研究机构对未知用药历史的样品进行农药残留的检测分析，以对农产品、食品或环境介质的质量进行监督、评价和判断。10.农药残留分析程序：一般包括
6、样品采集、样品预处理、样品制备以及分析测定等程序。但农药残留分析的操作程序因试验目的而不同。以研究农药安全性为目的，则操作程序包括：田间试验设计采样样品前处理检测报告；以研究食品安全性为目的，操作程序则包括：样品初筛采样样品前处理检测报告。11. 新有效成分农药正式登记时，对残留分析资料的要求：残留资料是在中国 2 个以上自然条件或耕作制度不同的省级行政地区、2 年以上的田间残留试验报2告，是农药安全性评价的重要内容。农药残留包括农药母体及其有毒代谢物，因此残留资料也应包括对代谢物的分析资料。具体内容包括：样品提取净化步骤及其涉及的仪器和操作条件。残留分析方法。包括方法来源、原理、仪器、试剂、
7、操作步骤、结果计算、方法回收率、灵敏度、变异系数等。方法必须在中国可行，否则必须加以改进。登记农药在申请登记作物的可食部分、土壤耕作层(020cm)、水( 仅对水田)中的残留量和时间的关系( 即消解动态)。第二章 农药残留样品的采集1. 样品的种类：农药残留分析样品按其来源可分为主观样品和客观样品。 主观样品 是人们为研究农药残留量与各种因素关系，从设计的试验区域内采集的样品。 客观样品 多指监测样品和执法样品，这些样品来源于非人为设置的试验区域，测定的农药残留种类是未知的或施药背景不清楚的样品。从动态群体（如流动的河水，循环的血液或生产线上的传送带）中取样要同时考虑样品空间分布和时间分布的代
8、表性。按照 IUPAC（国际纯粹与应用化学联合会）和 ISO（国际标准化组织）提出的定义，从群体采集的送达残留分析实验室的样品材料称为实验室样品(1aboratory sample)；实验室样品经过缩分减量或经过精制后的样品称为检测样品(test sample)；从检测样品中称取出的用于分析处理的试样则称为 检测样份(test portion)；检测样份经过提取、净化处理后进入待测状态时则称为检测溶液(test solution)，而不再称为样品溶液(sample solution)。2.样品采集的原则和要求：采集的样品必须具有代表性；采样方法必须与分析目的保持一致；采样量应满足残留测定的精度
9、要求；取样和样品贮存过程中尽可能防止欲测定组分发生化学变化或者丢失；要防止和避免样品受到玷污，尽可能减少无关化合物引入样品；样品采取过程应保持前后的一致性。3.农药残留田间试验：农药残留试验的目的：了解农药在大田农作物施用后的残留消解动态以及不同施药水平与农药最终残留量的关系，并以此为重要依据，制定农药安全使用标准和满足农药登记的要求。规范残留试验(supervised residue trial)：指在良好农业生产规范(GAP)和良好实验室规范(GLP)或相似条件下，为取得推荐使用的农药在可食用(或饲用) 初级农产品和土壤中可能的最高残留量，以及这些农药在农产品、土壤(或水)中的降解动态而进
10、行的试验。原始沉积量：指农药喷施于农田后 12h 内药液刚干时，采样分析得到的残留量。4.残留试验设计原则根据农药产品推荐的使用方法，期望得到规范用药条件下的最高残留量。在田间试验进行时，对防治对象是否存在并不做要求。5.残留试验设计的内容（1）供试作物：一种剂型用于多种作物的农药产品，可在每类作物中选择 12 种作物进行试验。（2）田间试验的重复次数：根据残留试验性质，按照“农药登记资料”要求决定重复次数。一般要求 2 年试验，即至少 2 次重复。（3） 试验点选取：至少选择 2 个试验点 ， 而且这两个地区作物的生长条件应各具有一定的代表性 。（4）试验地条件：选择作物长势均匀、地势平整的
11、地块，试验地前茬与试验中不得施用与供试农药类型相同的农药。（5）试验小区大小：小区面积：一般为 30m2(根据不同作物可适当增减，如粮食作物不得小于 30 m2，蔬菜不得小于 15 m2，果树不得少于 2 株)。原则是小区的面积必须保证能多次重复取得有代表性的样本。重复：每个处理设 3 个以上重复小区。隔离：小区之间设保护行或田埂，还必须设对照小区，与处理小区间要有隔离带，避免飘逸、挥发3和淋溶污染。熏蒸、气雾、烟雾试验的小区为不同的仓库、大棚或温室。排列：试验小区的设计应按施药量、施药次数、施药时期等因素随机排列。但为了避免污染，小区可以按照用药量由小至大排列。同时要注意灌溉行的流水方向和风
12、向，浇水时不能串灌。（6）施药方法和器具：残留试验的施药方法和器具，原则上采用当地使用的常规施药方法和器具。试验前要求对施药器具进行彻底清洗，保证施药均匀一致，并能严格控制施药量。（7）其他农药的使用：为保证试验作物正常生长，必须使用其他农药时，选择对试验农药分析没有干扰的农药品种，在处理小区和对照小区均一处理。对使用过的农药及时间、剂量等应做详细记录。（8）最终残留水平试验施药剂量：最终残留水平试验设两个以上施药剂量。原则上在不产生药害的前提下，以登记时的最高推荐剂量作为残留试验的低剂量，以其 1.5 倍或 2 倍的剂量作为残留试验的高剂量。施药量应以农药有效成分计，其单位应与标签上的单位一
13、致。如对水稻、小麦、蔬菜等作物的施药量以“g/hm 2”表示；对果树、茶树等的施药量以“mg/L”表示。(2)施药次数：原则上以登记时推荐的防治次数和增加 1 2 次的次数作为残留试验的施药次数，一般要求设两种以上施药次数。有的土壤处理剂、种子处理剂(拌种剂) 、除草剂或植物生长调节剂等，每季作物只施一次药，残留试验的施药次数可不增加。6.农药残留田间试验样品的采样方法：根据试验目的和样品种类实际情况确定采样方法。通常有随机法、对角线法、五点法、Z 形法、S 形法、棋盘式法、交叉法等。注意：应避免采有病、过小或未成熟的样品；采果树样本时，需存植株各部位(上、下、内、外、向阳和背阴面) 采样。采
14、样量大小主要取决于样品的种类；采土壤样本时，一定要保持每次采样操作规范及深度一致，一般要求采 015cm( 耕作层)土样(残留消解动态试验采集 010cm 土层样品) ；应同时采对照小区作为空白样本；采样时，为避免交叉污染，先采对照小区，然后从低浓度向高浓度依次采样，每个小区采集一个代表性样品。7.商品取样的目的：商品取样包括监测调查取样和执法取样。监测调查取样的目的：了解农药残留在食品中的发生概率、分布趋势和存在水平，或者对进出口食品的农药残留进行抽检，所以监测取样必须是完全随机的。取样数和取样点的选择根据其所代表的生产量，不带任何倾向，样品采集点尽可能接近消费实际。这类取样如果是生产流水线
15、的动态样品，可按一定的时间间隔或数量间隔抽取分样，残留分布不均匀的样品，应适当增加分样数。执法取样的目的：强制性检查取样对象中的残留量水平是否符合或超过农药最大残留限量(MRLs)。这类取样根据对事先用药历史的了解、农药残留分析的过去超标情况和预期农药残留问题较突出的可能地区或可能农产品而制定的。这类取样计划是非统计学的，不代表全面的农药残留情况，样品采集尽可能接近生产点，以便在产品进入消费者之前就截断残留分析后查出的超标产品。8.样品的贮存：要考虑样品待分析时间、样品性质、待检测农药性质等因素。一般情况下，运到实验室的样品要保存在冷藏条件(15 )下，并应尽快检测(几天之内)；如需贮存较长时
16、间，则样品必须在冷冻条件下贮存(-20 以下)，解冻后应立即测定，有些农药在贮存时可能会发生降解，需要在相同条件下做添加回收试验进行验证，取冷冻样品进行检测时，应不使水、冰晶与样本分离，必要时应重新匀浆；对有些送检样品（如干燥样品或罐头样品）必须保存在室温下同时控制环境湿度；水样只能在冷藏条件下贮存，或通过提取等处理，得到提取液，在冷冻条件下贮存。冷冻样品需继续冷冻状态保存。第三章 样品制备1.样品制备(sample preparation)：包括从样品中提取残留农药、浓缩提取液和除去提取液中干扰性杂质的分离净化等步骤，是将检测样品处理成适合测定的检测溶液的过程。其目的是使样品经处理后更适合农
17、药残留分析仪器测定的要求，以提高分析的速度、效率、准确度和灵敏度。样品制备 在农药残留分析中不仅最费时、费力、经济花费大， 其效果好坏直接影响到方法的检测限和分析结果的准确性，而且还影响分析仪器的工作寿命 。2. 样品制备的原理：主要是利用残留农药与样品基质的物理化学特性差异，使其从对检测系统有干扰作4用的样品基质中提取分离出来。化合物的极性和挥发性是指导样品制备最有用的理化特性。极性主要与化合物的溶解性及两相分配有关。挥发性则主要与化合物的气相分布有关。化合物的挥发性可用沸点(boiling point)和蒸气压(vapor pressure)两个参数来表示。由于沸点是指液体沸腾时的温度，而
18、我们常要了解的是物质在沸点以外温度的挥发性，所以，在农药残留分析中，农药挥发性的高低主要采用蒸气压这个参数。特别要注意的是，蒸气压只是部分地影响一个化合物从溶液中挥发出来的趋势，水溶性(或极性 )也同样产生影响。一个化合物在水中的挥发势是与蒸气压和水溶性二者相关的函数。蒸气压越高挥发势越大，而水溶性越强则挥发势越小。3. 提取 (extraction)：指通过溶解、吸着或挥发等方式将样品中的残留农药分离出来的操作步骤，也常称为萃取。提取方案的选择：主要是根据残留农药的理化特性来定。但也需要考虑试样类型、样品的组分(如脂肪、水分含量)、农药在样品中存在的形式以及最终的测定方法等因素。残留农药的提
19、取方法多种多样，但基本上都是基于化合物的极性-溶解度或挥发性- 蒸气压的理化特性而建立的。目前，残留农药常用的提取方法有溶剂提取法、固相提取法及强制挥发提取法三类。4. 溶剂提取法 (solvent extraction)是最常用、最经典的有机物提取方法，包括液液提取（液液萃取）和固液提取。固液提取主要用于固体样品(如土壤、动植物样品) 残留农药的提取，固液提取常用方法包括索氏提取法、振荡浸提法、组织捣碎法和消化提取法。溶剂提取法选用溶剂的要求：溶剂的极性，也即对残留农药的溶解性，这是要考虑的首要因素。一般来说，溶剂的提取效果符合“相似相溶”原理。所以，极性弱的农药(如有机氯类) 用弱极性的溶
20、剂(如己烷 )提取，而极性较强的有机磷农药和强极性的苯氧羧酸类除草剂等则用较强极性的溶剂(如二氯甲烷、丙酮、乙腈等)提取。有时为达到合适的溶剂极性也使用两种溶剂混合进行提取。溶剂的纯度。农药残留分析中对所使用溶剂的纯度要求非常高，有时可能因为溶剂中存在的杂质使得检测结果发生错误，应尽量选用农药残留级或环境保护分析专用试剂。若无优级试剂，可用分析纯试剂进行提纯处理，经检验合格后方可使用。溶剂的沸点。溶剂的沸点在 4580之间为宜。沸点太低，容易挥发，而沸点太高，不利于提取液的浓缩，可能导致一些易挥发或热稳定性差的农药损失。另外，如果使用电子捕获检测器，则不能使用含氯的有机溶剂。5. 固相提取法(
21、SPE ，solid phase extraction)：又叫液固提取法(1iquid-so-lid extraction)。它是指液体样品中的分析物通过吸着作用(吸附和吸收 )被保留在吸着剂(sorbent)上，然后用一定的溶剂洗脱的过程。它是利用吸附剂对农药和干扰性杂质吸着能力的差异所产生的选择性保留，对样品进行提取和净化。固相提取法特点：具有提取、浓缩、净化同步进行的作用；具有重复性好、省溶剂、快速、适用性广、可自动化和用于现场等优点；在农药残留分析中，尤其是对较强极性农药(如氨基甲酸酯类农药)的提取能发挥很好的作用。用途：目前主要用于水样中分析物的提取，但也越来越多地用于食品中农药残留
22、分析样品的制备。固相提取吸附剂的分类：正相和反相吸附剂。正相吸附剂(如硅胶、弗罗里硅土、中性氧化铝等) 属极性保留，溶剂极性越强，洗脱能力越强；反相吸附剂(如 C18、C 8、C 2、CH、PH 等) 属非极性保留溶剂极性越强，洗脱能力越弱。由于农药残留分析中的固相提取主要是水样，要使其中的农药被保留而提取出来，就要使水的洗脱能力最弱，所以要使用反相吸附剂进行提取。最常用的反相吸附剂是 C18(十八碳烷基键合硅胶)。正相吸附剂主要用于提取后样品的净化处理。固相提取可持留农药在柱子中，然后用溶剂洗脱进行分析，也可以持留样品中的杂质，让农药通过，然后收集用于分析。水样残留农药一般用前一种方式，而食
23、品、动植物样品残留农药一般用第二种方式。吸附容量和穿透体积：吸附容量(adsorption capacity)是指单位质量吸附剂所能吸附有机化合物的总质量；穿透体积(breakthrough volume)是指在固相提取时化合物随样品溶液的加入而不被自行洗脱下来所能流过的最大液样体积，也可以理解为样品溶液的溶剂对样品中残留农药的保留体积。它是确定上样体积和衡量浓缩能力的一个重要参数。例如：估计某水样甲胺磷的含量在 0.05gmL 以下，仪器的检测限为 25 ng，甲胺磷水溶液对 360 5mg C18 柱的穿透体积为 1.2 mL，这样可以知道，在上样时其体积就只能在 1.2 mL，以下，超过
24、这个量就会有甲胺磷流失，而耍达到检测限，水样的体积只需要 0.5 mL，所以该柱可以用来提取。固相提取的方法步骤：由于残留农药的固相提取主要是水样，多使用反相提取柱，其典型的固相提取操作分为四个步骤。首先是柱的活化和平衡，用适当的溶剂冲洗以活化吸附剂表面，然后再用水冲洗让柱处于湿润和适于接受样品溶液的状态；然后是上样，将用水稀释的样品溶液加在柱上，减压使样品通过柱子；第三步是清洗，即净化步骤，以比水极性稍弱、能洗脱杂质而让分析物保留的溶剂过柱，除去干扰物；最后是洗脱步骤，用少量极性再弱些的溶剂将分析物洗脱回收，用于测定。6.固相微提取(SPME，solid phase micro-extrac
25、tion)： SPME 原理是利用固相提取的方式实现对样品的分离和净化，但所用的固相材料及其分离机制不同。SPME 法不是将待测物全部分离出来，而是通过残留农药在样品与固相涂层之间的平衡来达到分离目的。将萃取头（涂渍有吸着剂的玻璃纤维）浸入样品中，样品中的残留农药通过扩散原理被吸附在吸着剂上。当吸着作用达到平衡后将玻璃纤维取出，置于气相色谱(GC) 或高效液相色谱 (HPLC)等分析仪器进样口，进行热解吸(GC)或溶解(HPLC)，并完成样品的检测过程。农药吸着量与样品中残留农药的原始浓度成正比关系，因此可以进行定量分析。 影响萃取效果的因素：主要有萃取纤维(膜) 的类型、厚度、萃取时间、离子
26、浓度、萃取温度、搅拌速度等。影响解吸的因素主要有解吸温度、萃取纤维插入深度及时间。对于静态解吸，萃取物在溶剂中的溶解度也是影响解吸的重要因素。SPME 的操作方法：A 直接固相提取法 (D-SPME)：D-SPME 是将涂渍纤维直接插入样品中，对残留农药进行提取，适用于气体、液体样品的分析。B 顶空固相提取法 (HS-SPME)：HS-SPME 是将表面涂渍纤维置于样品的顶端空间提取，不与样品直接接触，是根据气相中的残留农药与涂层平衡分配而开发的一种顶空固相提取技术，适合于各种基体的样品，包括大气、水、土壤、动植物组织中挥发和半挥发性农药的分析。7.超临界流体萃取法(supercritical
27、 fluid extraction，SFE):利用超临界流体在临界压力和临界温度以上具有的特异增加的溶解性能作为溶剂，从液体或固体基体中提取出特定成分，以达到提取分离目的。超临界流体对有机化合物的溶解度的增加非常惊人，一般能增加几个数量级。超临界流体的定义：物质处于其临界温度和临界压力以上状态时，向该状态气体加压，气体不会液化，只是密度增大，具有类似液态性质。同时，还保留气体性能，这种状态的流体称为超临界流体(supercritical fluid)。超临界流体的特点：超临界流体既具有液体对溶质有比较大的溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性，传质速率高于液相过程。表面张力小，很容易渗透
28、到样品中去，并保持较大的流速，可以使萃取过程高效、快速完成。在临界点附近，压力和温度的微小变化都可以引起流体密度的很大变化。 （因此，可以利用压力、温度的变化来实现提取和分离过程。 ）超临界流体萃取的操作方式可分为动态、静态及循环萃取 3 种。8.加速溶剂萃取(accelerated solvenl，extraction，ASE): 加速溶剂萃取是通过提高萃取剂的温度和压力，以提高萃取效率和加快萃取速度的新型高效萃取方法。该法适用于固体和半固体样品的制备。9.微波辅助萃取法(MASE，mircrowave assisted solvent extraction): MASE 主要有高压和常压两
29、种方式。10.超声波萃取(ultrasonic wave extraction):亦称超声波辅助萃取，ultrasound assisted extraction),是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。11:基质固相分散萃取(matrix solid-phase disPersion，MSPD): MSPD 步骤包括试样的均质化、装柱、干扰物质的洗脱、目标物洗脱等过程。12.强制挥发提取法(forced volatile extract
30、ion)：是对于易挥发物质，特别是蒸气压或亨利常数高的化合物，利用其挥发性进行提取的方法。吹扫捕集法操作步骤：吹沸；捕集；解吸；GC 分析顶空制样操作步骤：加热密封样品瓶，使顶空层分析物平衡；通过注射器将载气压向样品瓶；6断开载气，使瓶中顶空层气样流入气相色谱仪供分析。13.为什么提取液要经过浓缩过程才能用于分析？这一操作中要注意什么问题？由于农药残留分析中分析物在样品中的量非常少，而且常规溶剂提取法所用溶剂的量相对来说就非常大，从样品中提取出来的残留农药溶液，一般情况下浓度都是非常低的，在做净化和检测时，必须首先进行浓缩(concentration)，使检测溶液中待测物达到分析仪器灵敏度以上
31、的浓度。目前一些新的提取方法，如固相提取、吹扫捕集法等可同时实现样品浓缩。在浓缩过程中，必须注意残留农药损失和样品污染两个问题。由于样品提取液体积非常大，一般都在几十到几百毫升范围，要浓缩到 1 至几毫升，容易引起残留农药损失，特别对于蒸气压高或亨利常数高、稳定性差的农药，更应该注意不能蒸干。这些农药甚至在样品制备好以后，都应存放在密闭和低温条件下。14.常用的浓缩方法：有减压旋转蒸发法、K-D 浓缩法、氮气吹干法等，可结合实际需要选择使用。15.净化：是指通过物理的或化学的方法除去提取物中对测定有干扰作用的杂质的过程。净化主要是利用分析物与基体中干扰物质的理化特性的差异，将干扰物质的量减少到
32、能正常检测目标残留农药的水平。其中，物理的方法有：分配(极性) 、沉淀(溶解性) 、挥发( 挥发性)以及层析(极性)；化学的方法有：分配(酸-碱性)、浓酸碱(降解作用)、氧化(降解作用) 、衍生化(分子改变) 等。16.常用净化技术柱层析法；凝胶色谱净化；液液分配法；吹扫共馏法；其它净化法（磺化法、低温冷冻净化法（沉淀净化法） 、凝结剂沉淀法） 。17.常用来做净化处理的层析柱：弗罗里硅土柱。 氧化铝柱。 硅胶柱。活性炭柱。其他填料层析柱。弗罗里硅土柱。弗罗里硅土(Florisil)是农药残留分析净化中最常用的吸附剂，也称 硅镁吸附剂，比表面积达 297 m2g。弗罗里硅土要经过 650的高温
33、加热 13 h 活化处理，才能提高对杂质的吸附能力，而不影响农药的淋洗率。普通商品仅通过 110或 260温度活化，故应先在 650温度下重新加热一次。处理后的弗罗里硅土贮放在干燥器中能维持 4 d 活性，过期后应在使用前在 130加热过夜，国外不少实验室将弗罗里硅土一直保存在 130的烘箱中。氧化铝柱。 有酸性、中性、碱性之分，可根据农药的性质选用。有机氯、有机磷农药在碱性中易分解，用中性或酸性氧化铝。均三氮苯类除草剂则使用碱性氧化铝。氧化铝柱最大的特点就是淋洗液用量较少，但一般由于氧化铝的活性比弗罗里硅土要大得多，因而农药在柱中不易被淋洗下来，当用强极性溶剂时，则农药与杂质又会同时被淋洗下
34、来，所以在应用前必须将氧化铝进行去活处理。市售的吸附层析活性氧化铝 (中性或酸性 )， 先在 130左右温度下活化 4h 以上，然后加入相当于5 10重量的蒸馏水，在研钵中仔细混合，倒入瓶中盖紧，放置过夜，使活性一致 。硅胶柱。 通常也需活化处理除去残余水分，使用前再加入一定量的水分，以调节其吸附性能。 由于硅胶的吸附能力与其表面的硅羟基数目有关，一般在活化时温度不宜超过 170，以 100 110为宜 。操作时，一般硅胶的量为 550g，含水量在 010之间。活性炭柱。 活性炭(active carbon)柱层析一般很少单独使用，经常与弗罗里硅土及氧化铝按一定比例配合使用。活性炭对植物色素有
35、很强的吸附作用。将活性炭与 510 倍量的弗罗里硅土和氧化镁及助滤剂 Celite545 等混合，用乙腈-苯(1 ：1)做淋洗剂，能有效地净化许多有机磷农药。其他填料层析柱。 A 固相提取柱；B 离子交换柱(ion exchange)。18.凝胶色谱：是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的色谱柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶色谱的实质是筛分效臆，故又称为体积排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)。根据所用凝胶的性质，凝胶色谱可以分为使用有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，G
36、PC)和使用水溶液作为流动相的凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)两大类。农药残留样品净化中最常用的凝胶渗透色谱填料：苯乙烯-二乙烯苯共聚物(SDVB) ，如 SX-3，通过控制其聚合时的交联度来获得所需孔径的凝胶粒子。由于大多数农药的分子质量都在 400u 以下，选择一7定孔径的填料就很容易地除去提取液中分子质量在 400u 以上的杂质。淋洗剂一般用二氯甲烷、1：1 二氯甲烷-环戊烷或 1：1 乙酸乙酯 -环戊烷。特点：使用凝胶渗透层析做净化处理没有不可逆保留问题，而且一根柱子可以重复使用上千次，速度快、成本低，适于动植物组织、果蔬、加工食品、土
37、壤、牛奶、血液、水等几乎所有样品的净化处理。19. 样品制备效果的确认样品制备的效果确认通常是用测定添加回收率的方法进行，即在样品中添加已知量的待测定农药的标准物质，经过样品制备后，以添加标准物质的样品的测定值和空白样品的测定值之差与添加标准物质的量之比即为添加回收率： 10%加 标 量加 标 试 样 测 定 量回 收 率测定回收率时，一是要求尽量用不含目标农药的空白样品，如果无法做到，则加标样份和对照样份一定要取自充分混匀的同一份样品材料，同时要测定与样品制备过程完全相同但不含样品的溶剂空白；二是加标的浓度范围应接近样品测定中分析物质的浓度范围，可设高、中、低三个浓度梯度，最低浓度应低于该农
38、药的最大残留限量(MRL) ，或者按仪器的最低校准浓度 (LCL，lowest calibrated level)设定，最高浓度根据测定的实际浓度范围定，每个浓度应做 3 次以上的重复，以求得回收率的标准偏差和变异系数。一般对于单残留分析方法的回收率范围要求在 80110，但在缺少合适的残留分析方法或是在较低的检测浓度情况下，以及在多残留分析时，回收率稍低一些的方法也是可以接受的。第四章 农药残留分析的质量控制1.农药残留分析质量控制的目的：是使分析结果达到预定的准确和精密程度。为了达到这一预定目的所应采取的措施和工作步骤都是事先规划好的，通过一系列的规约加以确定，并要求有关分析人员按照规约操
39、作，由此使分析过程处于受检状态。2.试剂：为了确定溶剂的纯度是否满足农药残留分析的要求，对市售的溶剂按下法检验：（1）取 300mL 溶剂，放入旋转蒸发器中，浓缩至 5mL。取 5L，在准备应用的色谱条件下，注入气相色谱仪内，在色谱图上于 260min 内，不应有 1mm 以上的杂质峰。（2）某溶剂在整个分析方法过程中使用一定数量，取总量的 2 倍量，浓缩并定容到最小体积，取最大进样量进样，不出现杂质峰或产生小于噪音 12 或小于 12mm 的峰为标准。3. 标准物质(Reference Material，RM) ：具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料
40、赋值的材料或物质。有证标准物质(Certified Reference Material，CRM)：附有证书的标准物质。其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。标准物质一般分为两级：一级标准物质、二级标准物质。农药标准物质在农药残留分析中的作用： 农药标准物质是开展农药残留分析工作的先决条件，也是测定结果准确与否的质量保证。主要作用是测定方法的建立或验证已有方法的不确定度和精密度。另外，对于中介的授权质检机构必须采用有证农药标准物质，才能开展农药残留的检验工作，对农产品中的农药残留指标进行判定。农
41、药标准物质是实现农药残留准确一致的测定、保证量值传递的计量标准。采用标准物质开展检验工作还可以保证测定结果的可比性，达到量值的统一。农药纯品(Pure Pesticide)：是指目前对农药提纯和鉴定技术最高水平所能达到的条件下，纯化出的能够真正反映农药化合物本身特性的高纯度物质。农药纯品和农药标准物质的区别 ： 农药纯品不同于农药标准物质，而是农药标准物质的原材料。它仅有科技含量，没有业务主管部门的授权和认可。农药纯品除不具有量值传递、质量检验功能以外，其他的功能还是具备的，如用于教学和科学研究工作等。农药纯品若要成为农药标准物质必须按照国家有8关业务主管部门的一套程序和管理办法进行制备、鉴定
42、、定级和定值。4.方法灵敏度：在农药残留分析中，方法的灵敏度常用最小检出量(LOD，limit of detection)或最低测定浓度(LOQ，limit of quantification)表示。第五章 农药残留测定方法5.1 气相色谱法1.气相色谱法的特点：分析速度快：分析一个农药样品通常仅需数分钟，即使复杂的样品也只要几十分钟，并且分析所需样品量很少，通常只需 12L 甚至更少。分离效率高：高效色谱柱(特别是毛细管柱) 可以分离非常复杂的多组分样品，为农药多残留分析提供了有效的途径。灵敏度高：高灵敏的检测器可以检出 110-10110 -12g 的组分，适合于农药残留的微量和痕量分析。
43、选择性高：气相色谱固定相对性质相似的组分具有较强的分辨能力。通过选用高选择性的固定液，使各组分间的分配系数有较大的差异而实现分离。此外，不同类型的检测器对某类农药有较高的响应，如电子捕获检测器适合对有机氯农药的分析、火焰光度检测器适合对有机磷和含硫农药的分析、碱焰离子化检测器适合对氨基甲酸酯类农药的分析。适用范围广：大多数农药的分子量在 400U 以内，其沸点在气相色谱工作温度范围内，大多数农药可用气相色谱法测定。2. 气相色谱仪的组成：供气系统：包括高压钢瓶、减压阀、净化管、稳压阀、压力表、流量计等部件。进样系统：包括进样器和气化室。气化室是一个加热器，它将液体样品瞬时气化并预热载气，载气将
44、样品带入色谱柱。分离系统：包括色谱柱和恒温箱。色谱柱是气相色谱仪的核心部分，样品的分离过程在色谱柱内进行，经分离的组分随载气进入检测器。恒温箱保持色谱柱的温度恒定或按一定程序升温。检测器室：包括检测器和恒温室。检测器对从色谱柱流出的组分及其量的变化做出响应，并把这个变化转变成电信号送到放大器，记录成色谱图，它是气相色谱仪的关键部件。恒温室使检测器温度保持恒定。温度控制部件：主要给气化室、柱恒温箱、检测器室加热，并控制柱恒温箱和检测器保持所需的温度，一般要求控温精度在0.10.5之间。放大器：它把检测器输出的信号进行放大。记录和数据处理：将放大器放大了的信号记录成色谱图或通过数据处理进行自动记录
45、峰数、保留时间、峰面积，并计算出结果。3. 分配原理：气相色谱主要利用各组分在流动相(气相)和固定相之间的分配系数的不同以达到分离的目的，这与色谱过程的热力学性质有关。同时，两组分的分离效能还与其在色谱柱中传质和扩散行为即色谱动力学有关。分配系数 K。气液分配色谱分离是样品组分在固定相和流动相之间复多次地分配过程，可以用组分在两相间的分配来描述。分配系数是在一定温度和压力下组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比值，即(5.3)msC组 分 在 流 动 相 中 的 浓 度组 分 在 固 定 相 中 的 浓 度分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的。它是每一组分的特征值，只随柱温和柱
46、压变化，9与气相和液相体积无关。分配系数是气-液分配色谱中的重要参数，如果两个组分的分配系数相同，则它们的色谱峰重合；反之，分配系数差别越大，则相应色谱峰分离得越好。分配比 k。分配比又称容量因子，指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，固定相和流动相中的组分的质量比，即(5.4)msc组 分 在 流 动 相 中 的 质 量组 分 在 固 定 相 中 的 质 量k 值大小取决于组分本身和固定相的热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化，也与流动相及固定相的体积有关。k 值是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数，k 值越大，组分在固定相中的量越多，柱的容量越大，保留时间越长；愚为零时，则表
47、示该组分在固定液中不溶解。分配系数 K 及分配比 k 与相对保留值 的关系。两组分的相对保留值 决定于分配系数 K 或分配比 k。三者之问的关系如下：(5.5)1212Kktar式(5.5)表明，如果两组分的 K 或 k 值相等，则 a=1，两个组分的色谱峰重合；两组分的 K 或 k 值相差越大，则分离得越好。4. 速率理论及影响柱效率的因素：范弟姆特(Van Deemter)等的速率理论认为，色谱峰扩展的原因是受涡流扩散、分子扩散、气液两相间传质阻力的影响：H=A+Bu+Cu (5.14)式中 A 为涡流扩散项； Bu 为分子扩散项；Cu 为传质阻力项；u 为数气线速度。涡流扩散项与载气流速
48、无关，与色谱柱内填充物颗粒大小及其均匀性有关。填充越不均匀，颗粒直径越大，则峰扩展严重，柱效率降低。分子扩散项是由于组分在气相中的浓度差扩散所引起的。它与组分的性质、柱温、柱压和载气性质有关。载气线速较大时，分子扩散项变化很小，色谱峰扩展与载气线速成反比。传质阻力项包括液相传质阻力和气相传质阻力。气相传质阻力就是组分分子从气相到两相界面间进行交换时的传质阻力，这个阻力会使柱子的横断面上的浓度分配不均匀。这种传质阻力越大，所需的时间就越长，浓度分配就越不均匀，峰扩展就越严重。液相传质阻力是组分从气液界面扩散到液相内部发生质量交换，达平衡后又返回气液界面的传质阻力，在整个传质过程期间受到的阻力越大
49、，需要的时间就越长，与未进入液相的分子间的距离就越远，色谱峰扩展就越严重。5. 色谱柱：气相色谱柱分为填充柱和毛细管柱两类。色谱柱内填充的固体物质称为固定相。根据固定相的不同，可把气相色谱法分为气固色谱和气液色谱。农药残留分析常用的是气液色谱柱。气液色谱固定液。气液色谱填充柱内是惰性固体载体上涂渍一薄层固定液的固定相，固定液的不同直接影响到待测组分的分离效能，固定液的选择是气相色谱分析中的关键环节。固定液在操作温度下必须是液态物质，且应具备以下条件：对组分的选择性好：固定液对组分应有不同的溶解性(良好的选择性) ，在操作条件下，固定液能使欲分离的两组分有较大的相对保留值。蒸气压低：蒸气压低，固定液不易流失，可以保持柱效，也不影响高灵敏度检测器的使用。热稳定好：在操作温度(柱温) 下，固定液不发生分解或聚合反应，保持原有特性。化学惰性好：固定液不与待测组分、载体、载气发生化学反应。凝固点低、黏度适当：凝固点低，在低温下可以使用，黏度适当则可减少因柱温下降黏度变大而造成柱效降低的弊端。溶解力
