1、树突状细胞瘤苗的制备与临床应用进展邹征云 刘宝瑞南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科,江苏 南京 210008摘要 树突状细胞瘤苗可诱导荷瘤动物的保护性抗肿瘤免疫应答反应，这一发现使肿瘤治疗领域倍受鼓舞。本文综述肿瘤免疫治疗中树突状细胞瘤苗的基础研究与临床应用进展。关键词 树突状细胞/免疫学;癌症疫苗;综述文献中图分类号 R730.51Advances in the Preparation and the Clinic Application of Dendritic Cell-Based Tumor Vaccines Zou Zheng-yun,Liu Bao-rui. Departmen
2、t of Oncology, Nanjing Drum Tower Hospital, Faculty of Medicine, Nanjing University, Nanjing210008,China.Abstract:Dendritic cell-based tumor vaccines can induce tumor models protectitive antitumor immunity,and these inspire us.This paper reviews current advances in the preparation and the clinic app
3、lication of dendritic cell-based tumor vaccines for tumor immunotherapy. Key Words: dendritic cells/immunology;cancer vaccines;review literature树突状细胞（dendritic cell）简称 DC，是体内最有效的专职抗原递呈细胞（APC），通过 MHC、类途径将外源性抗原呈递给 CD3+CD4+及 CD3+CD8+T细胞，诱导机体产生抗原特异性CTL，识别和杀伤肿瘤细胞；通过 IFN- 等细胞因子的分泌而抑制肿瘤血管生成；同时激发免疫记忆保护，在宿主再
4、次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用。有关 DC的研究国内已有多篇文献综述发表，但集中阐述 DC制备过程优化及临床应用进展的文献却较缺乏。本文将近年来有关树突状细胞瘤苗制备中的基础研究与临床应用最新进展作一综述。1 DC的基础研究1.1 DC的来源、分类及制备技术体内大多数 DC来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到脑以外的全身各个脏器；数量极少，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的 1%以 1下。目前，DC 可以从外周血或淋巴组织（如淋第一作者简介邹征云(1972-),女, 江苏姜堰人,主治医生, 硕士研究生 ,主要研究方向是恶性肿瘤的免疫治疗。南京大学硕士研究生毕业论文3巴结、淋巴液、脾脏）中直
5、接分离获得；亦可从骨髓、脐血或外周血中 CD34+前体细胞、PBMC中 CD14+或 CD14-前体细胞经培养获得。其中，CD 34+前体细胞培养过程中需加入 GM-CSF及 TNF-；CD 14+前体细胞培养过程中需加入 GM-CSF及 IL-4；CD 14-前体细胞培养过程中必须加入 GM-CSF、IL-4 及 TGF-。直接分离或从前体细胞经培养获得的 DC绝大多数是不成熟 DC（imDC）,其表型为 CD3-，CD 11-，CD 14-，CD 16-/CD56-，CD 19-，CD 33-，CD 40-orlow，MHC +,MHC +,CD80low,CD83-,CD86low,CD
6、45RA+;imDC体外激发混合淋巴细胞反应(MLR)的能力较弱,但具有极强的抗原内吞、加工处理能力。当 imDC在摄取抗原或接受到某些刺激（主要是炎性信号如 LPS、IL-1、IL-6、CD 40L、TNF- 等）或在单核细胞条件培养基（如 AIMV）中培养可分化成熟；成熟 DC(mDC),其MHC、类分子、辅助刺激分子、粘附分子的表达均显著提高，如 B7-1（CD 80）、B7-2（CD 86）、CD 58、ICAM（CD 54）、CD 40、与溶酶体相连的膜糖蛋白（LAMP）等；其中，CD1a+,CD11c+,CD83+是 DC成熟的标志。DC 在成熟的同时发生迁移，由外周组织进入次级淋
7、巴器官，在此激发同种混合 T淋巴细胞反应；mDC 抗原摄取、加工能力大大降低。1.2 DC与细胞因子及细胞表面分子之间的相互作用1.2.1 DC与 IL-4/GM-CSF:IL-4/GM-CSF是从小鼠骨髓途径制备 DC所必须的重要的细胞因子。动物实验证实采用 rGM-CSF/IL-4持续注射，每天 10g，共注射 7天。结果：小鼠脾脏中 DC的总量增加了 5.7倍，CD 11+DC增加了 2.7倍；髓系 CD11c+/CD11b+DC及淋巴结中CD11c+/CD8 +DC的量亦有所增加；产生的 DC主要集中在 T细胞富集的白髓区。IL-4/GM-CSF联合体内注射是诱导产生大量功能性 DC的
8、有效方法 1。 1.2.2 DC与 IL-13:Goxe等 2比较了有血清培养基 RPMI1640及无血清培养基 X VIVO 及AIMV这三种培养基对 DC的影响，发现 AIMV培养基联合 GM-CSF及 IL-13是最佳的培养基，较 AIMV培养基联合 GM-CSF及 IL-4或其他培养方式能够获得更多、更成熟、表型更稳定、更能有效刺激自体及异体 T 细胞应答反应的 DC。原因可能是 IL-4可促使Th0向 Th2分化，而 Th2对 DC 的形成有抑制作用。IL-13 却不同于 IL-4，它只作用于DC表面的 IL-4R，对 T淋巴细胞无影响。 1.2.3 DC与 CD40L:早期文献报道
9、 CD40L可促使 DC成熟。Chen 等 3对小鼠 B细胞淋巴瘤38C13 进行研究发现采用 38C13分离出的肿瘤独特型 Id连接 CD40L脉冲 DC后能够使DC所表达的 CD40、CD 80、CD 86、MHC表达上调，IL-12 的分泌量增加，抗 Id抗体应答水平提高，抗 38C13肿瘤的活性明显增强；而单独采用 Id负载 DC却无此种现象发生。说明 CD40L连接自体肿瘤抗原脉冲 DC能够诱导产生更强的抗肿瘤免疫应答反应。1.2.4 DC与 Flt3L:DC培养过程中加入 Flt3L，能够使 DC的扩增倍数提高 20倍 4。1.2.5 DC与 HSPgp96 :gp96是热休克蛋白
10、（HSP）的原形物质，当它与 DC表面的 CD91结合后可诱导 DC的成熟，促使 DC分泌 IL-1、IL-12 及单核细胞趋化因子-1，并上调 DC 表面的 MHC、MHC、CD 80、CD 86、CD 40的表达，从而诱导机体产生特异性 CTL，对表达 gp96的肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫应答反应 5。1.3 DC与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）DC与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）之间具有协同作用，DC 能通过 Th1细胞而解除 TIL所处的免疫抑制状态，使 TIL的抗瘤效应大大增强，依据如下：负载肿瘤抗原的 DC与 TIL共同孵育后可使 1)TIL的扩增倍数在第 21天时增加 9.4-14.3倍,2
11、)CD 3+CD56-TCR+（CD 4+及 CD8+）细胞量明显上调,3)使 T细胞限制性杀瘤效应增强,4)TIL 表达的 IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-6 mRNA增加 6。奥地利学者 Friedl等 7及国内学者刘剑勇等 8研究均发现采用肝癌全细胞冻融抗原致敏的 DC激活 TIL后，能显著增强 TIL对自体肿瘤细胞的杀伤力；Terheyden 等 9研究亦证实CD40L-CD154能促使 DC成熟，从而促使恶性黑色素瘤 TIL中特异性 CD8+及产生 IFN- 的 CD4+T细胞大量增殖，特异性抗肿瘤效应大大增强。这些研究为 DC与 TIL的联合应用走向临床奠定了理论基础。1.
12、4 DC与细胞因子所诱导的杀伤细胞（CIK）Martin等 10报道 CIK细胞培养的过程中加入自体 DC后 CIK细胞的杀瘤活性显著增强，但当封闭 IL-12后 CIK的杀瘤效应明显降低，推测 DC对 CIK杀瘤的增强效应可能与 DC分泌 IL-12及 DC与效应细胞的表面分子之间的相互作用产生的。国内学者研究亦发现慢性粒细胞性白血病患者的自体 DC-CIK与患者骨髓中的单个核细胞共同培养后 ph染色体转阴率明显高于 LAK细胞组 11。这些均说明了 DC与 CIK之间有协同作用。1.5 DC与各种肿瘤抗原DC必须负载肿瘤抗原才能建立抗肿瘤免疫应答，不同性质的肿瘤抗原负载 DC所诱导的抗肿瘤
13、效应强弱不等，有的甚至无效。所以，寻找合适的肿瘤抗原负载 DC尤为重要。1.5.1 全细胞性肿瘤抗原:由于目前大多数肿瘤细胞抗原类型尚未明确鉴定，因而给予全细胞性肿瘤抗原由 DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、呈递可谓方便有效。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。Schnurr等 12研究发现采用 200Gray照射或 43水浴 2h，所得到的凋亡的胰腺肿瘤细胞作为肿瘤抗原负载 DC较冻融抗原更易激发抗肿瘤免疫应答反应。1.5.2 抗原基因作为肿瘤抗原:大多数 MHC限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅 2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次
14、回输负载肿瘤抗原多肽的 DC。人们将肿瘤抗原基因以裸 DNA或 RNA的形式导入 DC，使 DC持续以合适的方式将肿瘤抗原的多个表位与 MHC结合，表达于 DC的表面，从而更有效的激活 T细胞产生抗肿瘤免疫应答反应。DF 3/MUC1抗原在人类乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等上皮性肿瘤中过度表达，将南京大学硕士研究生毕业论文5MUC1RNA转染 DC后 DC 将表达 MUC1及共刺激分子。将 1106转染后的 DC经MUC1+/MC38移植瘤鼠的尾部皮下注射，每周 1次，共 2次后，可在小鼠腹股沟淋巴结中检测到 MUC1+DC，荷瘤鼠产生了抗 MUC1+/MC38癌的免疫应答反应，使肿瘤消退；此外，从
15、小鼠体内分离得到的 CTL体外对 MUC1+/MC38肿瘤细胞亦产生了很强的特异性杀伤作用 13。Heiser 等 14采用自体肾癌细胞 RNA转染 DC体外诱导 T细胞进行杀瘤效应研究，具体过程如下：常规方法从肾癌患者 PBMC中制备 imDC，在培养的第 8天加入自体细胞 RNA，制成肾癌细胞 RNA转染的 DC瘤苗，再以 1：10 的比例每周 1次共 2次将 DC加入到 T淋巴细胞中，从而诱导产生了大量多克隆的效应 T细胞，其中，CD 8+T细胞至少占 45%；将效应细胞以 40：1 的比例与靶细胞混合培养，靶细胞包括原发灶、淋巴结及骨髓中的转移的肿瘤细胞、正常肾组织细胞及同种异体肾癌细
16、胞；结果所产生的多克隆的效应 T细胞对原发及转移肿瘤、异体肿瘤均有较强的杀伤作用，而对正常的肾组织细胞却无杀伤作用。结果提示：1)肿瘤细胞的表面抗原在正常组织中不表达或表达很低,2)肾癌间有共同抗原,3)临床若采用此方法是否会诱发产生自身免疫病仍有待进一步研究。Boczkowski 等 15研究证实，从黑色素瘤 B16/F10.9细胞株中分离的mRNA扩增后转染 DC，鼠体内注射亦能诱导出多克隆 CTL应答，对 B16/F10.9具有特异性杀伤作用。具体过程是将 B16/F10.9 肿瘤细胞植入鼠脚掌，当原发肿瘤长至直径5.5-7.5mm时切除肿瘤，2 天后采用上述瘤苗，每周 1次，共 3次；
17、结果，观察 25-30天，对照组鼠均发生了肿瘤的肺转移，肺重量增加的 4倍，且发生了其他器官转移；而治疗组未发生肺转移。Boczkowski 等还证实了术后肿瘤组织冰冻切片中分离的 RNA扩增后转染 DC仍能在体内诱导产生抗肿瘤免疫应答反应。由于术后大部分患者缺乏肿瘤细胞来源，因而从肿瘤组织冰冻切片中分离的 RNA不失为肿瘤抗原来源的较好途径。2 DC瘤苗的临床应用2.1 DC与预后Inoshima等 16分析 132例非小细胞肺癌患者切除标本时发现，血管内皮细胞生长因子（VEGF）、微血管密度（WVD）、浸润的 DC这三个因素均对预后有独立的影响作用；其中，VEGF水平与 WVD水平成正相关
18、，而与 DC量成负相关；VEGF 会抑制 DC的成熟；VEGF 含量增高及 DC量降低提示预后不良，反之较好。2.2 临床应用时 DC的回输途径及回输量DC回输途径已报道的有 5种：静脉回输，淋巴管注射，真皮内注射，瘤体内多点注射，恶性胸腹水时胸腹腔注射。其中淋巴管途径可使 DC直接到达淋巴细胞富集的淋巴结，引起混合性 T淋巴细胞应答；瘤体内注射可避免体外抗原的不足，均是较好的思路。大量临床报道DC回输的细胞数一般每次 106-108，低剂量的 DC回输可增强抗肿瘤免疫，过量 DC回输会导致T细胞耗竭而下调免疫功能，引发自身免疫病，抑制抗肿瘤免疫。 2.3 DC与前列腺癌西雅图 Northwe
19、st Hospital等 17应用前列腺癌膜相关抗原（PSMA）的 PSM-P1及 PSM-P2负载 DC对晚期前列腺癌进行期临床试验，结果，95 例患者中有 3例患者完全缓解（CR），25例患者部分缓解（PR），20 例患者病情无变化（NC），47 例患者疾病进展（PD），总有效率 50%；其中 19例激素抵抗性患者中有 12例（63%）生存期长达 600天，显著高于不治者（平均仅 6个月）。Heiser 等 18采用自体前列腺癌特异性抗原（PSA）RNA 转染 DC诱导 CTL治疗晚期前列腺癌，其期临床试验证实 PSA-mRNA 转染 DC治疗晚期前列腺癌安全、有效；期临床研究结果显示治疗
20、的 13例患者中 6例 PSA直线下降，3 例在分子水平上证实循环中的肿瘤细胞被清除。这两篇报道均说明 DC瘤苗用于临床治疗前列腺癌是合理、可行的。2.4 DC与恶性黑色素瘤Lau等 19采用 tyrosinase 368-376 及 gp100作为抗原肽负载 DC进行期临床试验治疗晚期恶黑，以 1107，310 7或 1108静脉注射，2 周 1次，共 1-2次；结果，治疗的 16例患者中，1 例 CR，2 例 SD，2 例产生混合反应（MR），无任何毒性反应发生。2.5 DC与肾癌Marten等 20采用自体肿瘤细胞冻融抗原脉冲 DC制备 DC瘤苗的、期临床试验治疗了15例晚期肾癌患者，结
21、果 1例 PR，7 例 SD，7 例 PD；3 例 DTH反应阳性，未见不良反应发生。Kugler等 21采用电融合技术将自身肿瘤细胞与同种异体 DC融合，产生融合细胞表达肿瘤抗原并具有 DC的共刺激能力，采用这种瘤苗对 17例晚期肾癌患者进行治疗；结果 4例 CR，2 例PR，1 例 MR，2 例 SD。4 例 CR中 3例患者在注射 2次后病灶消退，直至第 21个月仍未检测到肿瘤的复发或转移。杂交瘤苗注射后典型的表现为第一次注射后的第一个星期内肿瘤开始缩小，转移灶消失；但对大面积病灶患者效果略差。提示肿瘤细胞与 DC融合制成的杂交瘤苗极具应用价值及治疗前景。2.6 DC与胃肠道肿瘤黑色素瘤
22、抗原编码基因（MAGE）在恶性黑色素瘤及胃肠道肿瘤中选择性高表达。常规方法体外培养获得 DC经 MAGE-3抗原肽致敏 DC后体内注射治疗 12例患者，其中 6例胃癌，3 例食道癌，3 例肠癌；结果检测的 8例患者中有 4例体内产生 MAGE特异性 CTL；7 例患者肿瘤标记物下降；3 例病灶缩小 22。绝大多数胃肠道肿瘤及肺癌患者血浆 CEA水平增高，因而 CEA亦可作为靶点而用于免疫治疗。Itoh 23等采用 CEA652负载 DC制成瘤苗治疗了 10例消化道晚期肿瘤患者,结果未见任何毒副作用,2 例 DTH反应阳性，并持时长达 6-9个月；说明 CEA652致敏 DC制成 DC瘤苗可用于
23、 CEA阳性的肿瘤患者。南京大学硕士研究生毕业论文72.7 DC 与妇科肿瘤手术及放疗难以控制的晚期宫颈癌患者，化疗亦未见明显疗效，一年存活率仅 10-15%。Santin 等 24采用 HPV-18E7负载 DC治疗 1例晚期宫颈癌伴肺转移患者，结果患者病灶稳定长达 21个月，生活质量明显提高。2.8 DC与乳腺癌Brossart等 25用自体来源的 DC经 HER-2/neu或 MUC1来源的多肽脉冲 DC制成瘤苗，治疗了 10例晚期乳腺癌及卵巢癌患者；结果，5 例患者诱导出明显的特异性 CTL反应，且持时长达 6个月；其中经 MAGE-1致敏的 DC 几次注射后可诱导出对 CEA、MAG
24、E-3 特异的 CTL反应。说明在乳腺癌及卵巢癌患者体内，用单一抗原致敏的 DC体内注射后可诱导产生针对多种肿瘤抗原的免疫应答反应。2.9 DC与血液肿瘤Timmerman等 26采用肿瘤特异性免疫球蛋白（Id）-KLH 脉冲 DC治疗了 35例恶性淋巴瘤患者,结果:10 例初治患者中 8例产生了抗 Id的 T细胞应答反应,2 例 CR，这 2例无病生存时间长达 44月及 57月；1 例 PR，持时 12月；1 例分子水平缓解，持时达 75+月。25 例化疗无效患者经 DC瘤苗治疗后 4例 PR，16 例 SD，6 例 PD。说明 DC瘤苗可用于血液肿瘤。2.10 DC与中枢神经系统肿瘤Ash
25、ley等 27采用 B16肿瘤细胞提取物或 B16总 RNA转染小鼠源性 DC治疗 B16/F10鼠颅内肿瘤时发现这两种瘤苗均可使小鼠产生保护性免疫应答反应，中位生存期明显延长，达到 30天甚至 80天以上；而采用其它肿瘤细胞提取物制备的 DC瘤苗对照组的生存期仅 16天。治疗组治疗后病理证实颅内肿瘤发生了大面积的坏死、出血、炎症细胞的浸润，而对照组却无此现象发生。这一资料说明临床上 DC瘤苗可以用于治疗中枢神经系统肿瘤。3 结语DC在诱导机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用,DC 瘤苗安全无毒，是近 10年来肿瘤免疫治疗研究领域的一大热点。然而采用何种肿瘤抗原形式、采取何种方式负载 DC以诱导出最佳
26、抗肿瘤免疫应答效应仍有待进一步基础及临床研究证实；DC 瘤苗与其他效应细胞如 CIK细胞、TIL细胞间的相互关系也是非常值得研究的课题。总之，DC 瘤苗在抗肿瘤免疫治疗中极具研究前景及应用价值。参考文献:1 Basak SK, Harui A, Stolina M,et al. Increased dendritic cell number and function following continuous in vivo infusion of granulocyte macrophage-colony-stimulating factor and interleukin-4J.Blood,
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