1、核酸分子杂交,刘 向 华,（nucleic acid molecular hybridization）,DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY,核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。,应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等
2、方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。,检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。,核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性,第一节 核酸分子杂交的基本原理,一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization）,基本原理：DNA变性、复性与分子杂交,Hybridization,Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解
3、温度。（G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) %,融解温度：50杂化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的Tm值。 寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。 实际操作中，常选择低于Tm值5-10进行杂交。,Tm=4 X（G + C）+ 2 X（A + T）,杂交温度：,Tm=81.5 + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%）M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性,例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和50%甲酰胺，则其Tm值为
4、：Tm=81.5 + (-2.07) + 20.5 1 30.5=68.4 50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25 杂交温度应:68.4 - 25 =43.2 ,甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的Tm值，50%的甲酰胺可以使Tm降低30,影响核酸分子杂交的因素 探针的浓度、长度、复杂性 离子强度 温度与变性剂（甲酰胺） 杂交条件的严谨性,预杂交prehybridization,概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。,常用的封闭物： （1）变性的非特异性DNA:
5、如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。 （2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶粉,基本实验步骤：,Migration,hybridization,第二节 核酸探针,probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。,核酸探针的类型核酸探针的标记方法核酸探针的检测,按化学本质分：DNA探针RNA探针,按标记物分：放射性标记探针,核酸探针的类型,3H、32P、35S、125I等 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短,非放射性标记探针,生物素，地高辛、荧光素等,常用的探针标记
6、法：,（1）化学标记法：光敏生物素标记法,（2）酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。切刻平移法、随机引物法、末端标记法等,（1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标记物结合到核酸分子上.,光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团以共价键结合。,（2）酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。缺口平移法、随机引物法、末端标记法等,32P或35S同位素标记的单核苷酸,dig-dUTP的结构,（1）缺口平移法由DNA酶和大肠 杆菌DNA聚合酶 共同完成。,DNA酶：在双链
7、 DNA上随机打开若 干个单链缺口，产 生3-OH端,大肠杆菌DNA聚合 酶：53DNA聚 合酶活性； 53 外切核酸酶活性,（nicktranslation）,“边切除、边聚合”,最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。 DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。,随机引物（4-6nt）：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096,DNA聚合酶Klenow片段：53DNA聚合酶活性 弱35外切核酸酶活性无53外切核酸酶活性,（2）随机引物法（random primi
8、ng）,产物平均长度为400-600个核苷酸。 Klenow片段没有5 3外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。,DNA聚合酶Klenow片段标记法T4 DNA聚合酶标记法末端脱氧核苷酸转移酶标记法T4多核苷酸激酶标记法,（3）探针的末端标记：在5或3端通过酶促反应加上标记物,酶切,核酸探针检测方法,同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号,放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70曝光适当时间
9、（1-7天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。,非放射性标记探针：偶联反应+显色反应,Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联,Dig-DNA探针 + 抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）+ 底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色,核酸分子杂交固相杂交 液相杂交膜上印迹杂交 核酸原位杂交,核酸分子杂交的分类,第三节 核酸分子杂交技术,一、膜上印迹杂交,印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。,指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。,1固
10、相支持物的选择,特点： 较强的结合核酸的能力（10g/cm2）;与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等； 非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉; 具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。,常用的固相支持物：硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等,固相支持物的选择,良好的固相支持物应具备的条件： 具有较强的结合核酸分子的能力（10g/cm2） 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应 与核酸分子结合牢固 非特异性吸附少 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作,常用的固相支持物硝酸纤维膜、尼龙膜
11、、PVDF膜等,1、硝酸纤维膜：是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用， RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上在高盐浓度下，其结合能力80-100g/cm2吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上优点 杂交信号本底较低缺点 由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降对小分子量的DNA片段（200bp）结合能力不强靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移易破碎,2、尼龙膜：对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500g/cm2。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。 真空
12、干烤或紫外交联，核酸与膜以共价结合。优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂交信号的本底也高。,3、PVDF膜（聚二氟乙烯）：与尼龙膜相似其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强且在预杂交中很容易被封闭杂交本底低结实耐用，可多次杂交。,2印迹方法 Mechanics of transfer,虹吸印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic）,Blot DNA to membrane,Capillary Blotting (upward
13、) no special equipment required!,1975年 E. SouthernSouthern DNA 印迹转移技术,DNA片段15kb，18小时,Electrophoretic blotting,不宜用硝酸纤维素膜,一般23小时， 最多6 8小时,especially good for small fragments resolved by PAGE,Vacuum blotting,3060分钟,more efficient and quantitative than capillary must apply vacuum evenly and not too stro
14、ngly,3印迹类型,Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交反向斑点杂交菌落或噬菌斑杂交,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性,转移到NC膜，高温烘烤,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Southern blotting hybridization,检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否含有目的基因。可用于 基因组基因的定性及定量分析、 克隆基因的酶切图谱分析、 基因突变分析等。,预杂交,Paper Towels,Southern Blotting hybridization,tissue,SDS,Prot K,Phenol Chloro,Spin
15、,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性、转移到NC膜,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Prehyb/Hybridization/Rinses,检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。 DNA指纹图谱,Southern印迹杂交的应用：,Northern blotting hybridization 检测靶分子为RNA,RNA极易被RNase 降解 RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯),与Southern blotting hybridization不同之处： 不需要限制性核酸内切酶酶切。 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢
16、氧化汞等方法。 应用： 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。,Northern blotting hybridization,pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heart,muscle,GEF mRNA,Southern blotting hybridization,优点：简单、迅速（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测； 应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。,Dot and slot blotting hybr
17、idization 将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上,Reverse dot hybridization,直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。,DNA chip,Colony or phage hybridization 从重组DNA文库中筛选阳性克隆,二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）,用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片 中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂 交 液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用
18、密闭的湿盒。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。,探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位；探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进 行杂交，确定有无该病原体的感染。,应用：,The result of FISH The digoxigenin-labeled probe was visualized with anti-DIG-rhodamine（red） The biotin-labeled probe, with avidin-FITC（green）,核 酸 杂 交 分 类 表,斑点及狭缝印迹杂交,
