1、许冰莹, 昆明医科大学法医学院 Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_,第五章 STR自动分型(STR automatic typing),国际上通用的法医STR分型,Allele,PCR product,琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis),聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis),Examples of DNA in the News,2001 “911”, New York,2004Indian OceanTsunami,2008 Wenchuan Ea
2、rthquake,STR自动化分型的优势,扩增片段多在400bp以下，适合法医生物检材的特点；STR在人类基因组(genome)中分布广泛、多态性好；扩增效率高，阳性检出率大；突变率低;基因频率(Gene frequency )分布比较平均基因座杂合度(heterozygosity)0.8个人识别能力(Personal identification)0.9易于实现DNA分型的自动化、标准化和信息化；快速、灵敏、准确、稳定、重复性好易于实现实验室间的比对,PCR-STR,DNA提取(DNA extraction),PCR扩增PCR (amplification),PAGE,CE,银染(Silve
3、r stain),荧光染料(fluorochrome),High-Throughput STR Typing on the ABI 3100 (16-capillary array),256 data points in 45 minutes with STR 16plex and 16 capillaries,第一节 荧光标记STR复合扩增(Fluorescent tags STR composite amplification),常用的复合扩增方法有2种：银染系统(Silver stain)荧光标记STR自动检测系统(Fluorescent tags STR automatic detec
4、tion system ),Methods for Parallel Sample Processing,Multiplex by Number of Capillaries,方法,银染检测,荧光毛细管电泳检测,单基因座扩增(Single gene amplification),多基因座复合扩增(Composite amplification multiple ),荧光复合扩增毛细管电泳,激光诱导荧光染料显带自动分析 (Laser induced fluorescence dye with automatic analysis),荧光染料标记在每个基因座中一条引物的5端，不同基因座引物标记不同
5、的荧光标识物。经过扩增后的等位基因产物均携有荧光，电泳分离长度等位基因，用荧光扫描系统对凝胶检测。按照荧光的颜色区别基因座，根据片段的迁移率确定片段长度等位基因。,各基因座等位基因根据片段的电泳位置及荧光颜色而区分,扩增片段不重叠的基因座使用相同的荧光标记物,引物的5端标记,扩增片段重叠的基因座使用不同的荧光标记物,商品化试剂盒(Commercial kits) 数据库建设、实验室间比对自行设计STR基因座组合,关键点和难点,引物(primers)的选择,荧光染料标记,复合扩增条件的优化,引物选择,多态性好核心重复序列(Core repetitive sequence )规律片段大小符合法医学
6、应用引物的退火温度相似,6-FAM,VIC,NED,PET,荧光染料选择的原则,片段大小相同的基因座标记不同种类的荧光，片段大小不同的基因座标记同一种荧光,组合荧光染料的发射波长相差越大越好，通常20-30nm,同一种荧光标记的基因座等位基因之间相差在10bp以上,差值不应为4的整倍数,法医DNA实验室常用的STR复合扩增系统,4色或者5色荧光标记 分子量内标DNA片段（ROX或LIZ） 余下的3 or 4种标记STR基因座 1-6个STR/种,复合扩增条件的优化,引物(primes)浓度以及引物之间的混合比例退火温度(Annealing Temperature)的选择延伸温度(Stretch
7、ing temperature )和循环(cycle)的 时间镁离子(Mg2+)以及dNTP的浓度,单基因座扩增的条件,变性(denaturation)95C,45s,延伸(stretch) 72C, 45s,退火(annealing)59C, 45s,预变性(Initial denaturation)97,5min,60,60min,35,ABI ID试剂盒的扩增条件,变性95C,1min,延伸72C, 1min,退火59C, 1min,预变性 95,11min,60,60min,35,AmpFSTR Identifiler 试剂盒,Kit component,目前AB公司专门正对中国人群的
8、DNA多态性开发了名为“AmpFSTR SinofilerTM”的试剂盒，用多态性较好的“D12S391”和“D6S1043”取代了“AmpFSTR Identifiler ”试剂盒中的“TPOX”和“TH01”。,荧光染料分子的大小、形状会改变DNA-染料结合物的总体大小。存在于荧光染料上的离子电荷，会改变结合物的电荷质量比。荧光染料会影响STR等位基因的电泳迁移率(Electrophoretic mobility )。,等位基因分型标准（Ladder）： 需要标记同样的荧光染料，以消除荧光染料对迁移率(mobility)的影响。,STR自动分型,荧光标记复合扩增毛细管电泳检测确定等位基因基因分型图谱数据,高效灵敏准确稳定重复性好,
