1、中 国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009， Vol. 22 No. 9抗体（ Antibody， Ab）是机体免疫细胞被抗原激活后， B 细胞增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的一类能与相应抗原特异性结合并诱导相应生物学功能的糖蛋白 。抗体不仅在生物学 、基础医学和临床医学诊断领域得到广泛利用，而且在疾病的预防及治疗方面也显示出巨大的应用潜力 。FDA 批准的第 1 个用于临床治疗的抗体是 OKT3， SFDA 批准的第 1 个用于临床治疗的抗体是由武汉生物制品研究所研制的 WuT3，二者作为免疫抑制
2、剂，主要用于预防和治疗同种异体器官，如肾脏 、肝脏及心脏移植后的急性排斥反应 。治疗性抗体经历了 3 个发展阶段 。第 1 代为多克隆抗体，第 2 代为单克隆抗体，第 3 代为基因工程抗体 。单克隆抗体因其具有高效靶向性 、高特异性 、高亲和力以及能诱导一系列生物学效应，而被称为“魔弹 ”。然而，鼠源性单克隆抗体用于临床存在着诸多问题： 易引起人抗鼠抗体反应（ Human anti-mouse antibody response， HAMA）； 其 Fc 段不能有效激活人体 FcRn 及补体系统的效应功能； 在人体内的半衰期短，因而降低了其疗效； 反复使用易导致机体产生过敏反应等 。因此，临床
3、应用中理想的单克隆抗体应该是人源的，但人 -人杂交瘤技术目前尚未突破，即使研制成功，也存在人 -人杂交瘤体外传代不稳定 、抗体亲和力低及产量不高等问题 。目前，较好的解决办法是利用分子生物学技术和蛋白质工程技术，对异源性单克隆抗体进行改造 。基因工程抗体经历了从人鼠嵌合抗体 、人源化抗体 、小分子抗体 、噬菌体展示抗体 、核糖体展示抗体到全人源抗体的发展历程 。嵌合抗体最先由美国的 Morrison 于 1984 年研制成功 1。经过 20 多年的发展，嵌合抗体技术已经较为成熟 。人鼠嵌合抗体有以下特点： 不仅保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，而且使鼠源性成分减少 70%左右； 其人源Fc
4、段能有效介导生物学效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity， ADCC） 、补体依赖性细胞毒作用（ Complement dependent cytotoxicity， CDC）等； 能自由地选择抗体的型 、亚型 、类 、亚类 、大小 、结构域及添加糖基化位点等，以利用其不同的生物学特点及理化特性； 由高效真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体表达 “盒子 ”可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区，缩短操作和研制周期； 操作相对简单 。截至 2008 年，市场上批准用于治疗的嵌合抗体有 5 种，分
5、别为 abciximab（ 1994） 、rituximab（ 1997） 、basiliximab（ 1998） 、infliximab（ 1998）和 cet-uximab（ 2004），另外还有 6 种正处于临床研究中 2。作者单位：武汉生物制品研究所（武汉 430060） .通讯作者：杨晓明， E-mail： 中国图书分类号 Q782 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（ 2009） 09-0933-05 【综述 】人鼠嵌合抗体的基因构建胡迪超 综述 张爱华 杨晓明 审校【摘要 】 为了克服鼠单克隆抗体在人体治疗中出现的问题，经典的基因工程抗体技术将人源抗体恒定区替代鼠抗体的
6、恒定区，即构建人鼠嵌合抗体 。嵌合抗体不仅保留了亲本抗体的特异性和亲和力，大大降低了人抗鼠抗体（ HAMA）反应，而且可表现出不同的生物学功能和半衰期 。本文就嵌合抗体鼠抗体可变区基因的克隆 、人抗体恒定区基因的钓取 、鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因的拼接及表达载体和宿主细胞的构建作一综述 。【关键词 】 嵌合抗体；可变区；恒定区Construction of Human Mouse Chimeric Antibody GeneHU Di-chao, ZHANG Ai-hua, YANG Xiao-ming（ Wuhan Institute of Biological Products,
7、Wuhan 430060, China）【Abstract】 In order to solve the problems in treatment of diseases in humans with murine McAb, human mouse chimeric antibody is constructed by substitution of constant region of antibody from mouse origin with that of antibody from human origin throughclassical gene engineering t
8、echnique. The chimeric antibody maintains the specificity and affinity of parental antibodies, while decreases the human anti-mouse antibody （ HAMA） response significantly and shows various biological functions and half-life periods.The gene cloning at variable region of antibody from mouse origin,
9、gene isolation at constant region of antibody from human origin,splicing of variable region of antibody from mouse origin and constant region of antibody from human origin as well as constructions ofexpression vector and host cells are reviewed in this paper.【Key words】 Chimeric antibody; Variable r
10、egion; Constant region933 DOI：10.13200/j.cjb.2009.09.99.hudch.008中 国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009， Vol. 22 No. 91. 抗体的分子结构及主要特点天然的抗体分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键以及离子键 、氢键 、疏水键和范德华力等连接在一起形成 “Y”字形的四肽链分子 。重链氨基端近 1 4 区域的氨基酸序列复杂多变，被称为重链的可变区（ VH）；其余部分相对较保守，被称为重链的恒定区（ CH） 。轻链氨基
11、端近 1 2 区域的氨基酸变化较大，被称为轻链的可变区（ VL）；其余 1 2 区域的氨基酸较保守，即为轻链的恒定区（ CL） 。按照重链恒定区划分，抗体可分为 5 类： IgM、IgG、IgE、IgA 和 IgD。其中人 IgG 又分为 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 4 个亚类，而鼠 IgG 分为 IgG1、IgG2a、IgG2b 和 IgG3 4 个亚类 。轻链又可划分为两型： 型和 型 。小鼠体内的 型占 95%， 型为 5%；而在人体内， 型占 60%， 型为 40%。IgG、IgA 和 IgD 的CH1 与 CH2 之间存在一铰链区（ Hinge region），长度为
12、 10 60 个氨基酸不等 。铰链区富含脯氨酸，赋予了 Fab 较大的自由度，有利于抗体抗原反应；也含有数目不等的半胱氨酸，参与二硫键的形成 。铰链区较为伸展，易于被蛋白酶酶解消化 。因而，在构建人鼠嵌合抗体基因时，为发挥嵌合抗体的有效生物学功能及延长其半衰期，通常考虑构建 IgG1 型的嵌合抗体 。研究发现， 90%的 HAMA 反应是针对抗体恒定区的，因此将人的抗体恒定区，替代鼠单克隆抗体的恒定区可以大大减少 HAMA 反应 。2. 人鼠嵌合抗体的基因构建人鼠嵌合抗体的基因构建主要包括鼠抗体可变区基因的克隆 、人抗体恒定区基因的钓取 、鼠抗体可变区基因及人抗体恒定区基因的拼接以及高效表达载
13、体和宿主细胞的构建等 。2. 1 鼠抗体可变区基因的克隆2. 1. 1 从杂交瘤细胞基因组文库中筛选功能性可变区基因：在构建人鼠嵌合 IgG1抗体基因时，准确地克隆鼠抗体的可变区基因最为关键 。为了从杂交瘤细胞中获取目的基因 VH 和 VL，以往的文献报道是使用不同的限制性内切酶对杂交瘤细胞基因组DNA 进行酶解，再采用 Southern blot 法对酶解片段进行分析，从而获得目的基因 3。其基本流程为：从杂交瘤细胞中提取基因组 DNA，酶切消化后，电泳分离 15 000 20 000 bp 区段的 DNA； 离心提取 噬菌体 EMBL3 的 DNA，并制备双臂； 将杂交瘤细胞 DNA 与
14、DNA 双臂过夜连接，经体外包装后，转染受体菌 Q359，铺平板进行 噬菌斑培养；制备合适的 J、V、JH 和 VH 探针，杂交筛选阳性噬菌斑； 以同一酶切的肝 DNA 作对照，利用 Southern blot 分析基因重组的情况，确定所获得的功能性可变区基因，并进一步进行酶切分析和亚克隆 。所获得的目的基因片段不仅含有来自亲本抗体高效表达所需的启动子和增强子，而且还含有真核表达所必需的亲本抗体的信号肽序列，可以最大限度地保留亲本抗体的高特异性和高亲和力，并有利于高效表达 。但是，从基因组克隆中分离重排的重链和轻链 V区基因，需要建立基因组文库，不仅耗时，而且工作量极大，未知序列的引入亦可能影
15、响抗体的表达 。而且，基因组可变区中的内含子只有在淋巴类宿主细胞中表达才有助于提高表达量 。随着分子生物学技术的飞速发展， PCR 技术已被广泛应用于克隆抗体的 VH 和 VL 基因，使得目的基因的克隆变得简单而高效 。2. 1. 2 利用 RT-PCR 技术扩增鼠抗体的可变区基因：抗体的可变区由骨架区（ Framework region， FR）和互补决定区（ Complementary determining region，CDR）所组成 。互补决定区因其高度易变，又被称为高变区（ Hypervariable region， HVR），而可变区的骨架区相对保守 。因此，根据小鼠 Ig 重链
16、和轻链 V 区基因 5端和 3端相对保守的特点，可以设计相应的简并引物（ Degenerated primers），通过 RT-PCR 来扩增重链及轻链的相应功能区 。基于简并引物扩增鼠抗体可变区基因的引物设计方法主要有两种 4：一种是简并引物分别与抗体可变区基因骨架区 FR1和 FR4 互补；另一种是重链和轻链 V 区 5端引物与V 区的信号肽序列互补，重链 V 区 3端引物与 IgGCH1 5端及 V 区所有 J 基因 3端序列互补，轻链 V区 3端引物与 链 CL 5端和轻链 V 区所有 J 基因3端序列互补 。第 1 种方法由于 FR 序列较信号肽序列保守，因而较少的简并引物即可成功扩
17、增可变区基因，但引物的简并性及必要的酶切位点的引入可能造成抗体氨基端个别氨基酸的变异甚至缺失，从而影响抗体的亲和力 。由于无信号肽序列，也不利于真核表达有功能的抗体分子 。第 2 种方法虽然信号肽序列较易变化，但基本上不会造成 FR 区氨基酸的改变，而且还可以提供真核表达所需的信号肽序列 。2. 1. 3 利用 RACE-PCR 技术扩增鼠抗体的可变区基因：嵌合抗体要最终实现其生物学效应功能，必须在真核表达系统中进行表达 。由于不同的鼠抗体其信号肽序列不同，现有的简并引物还不能完全涵盖所有鼠抗体可变区 5端的信号肽序列 。因此，使用简并引物进行鼠抗体可变区的克隆仍有 15% 35%失934 中
18、 国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009， Vol. 22 No. 9败 5。Doeneckek 等 6建立了一种克隆抗体可变区基因的新方法 RACE（ Rapid amplification of cDNA ends） -PCR。RACE-PCR 是以 PCR 技术为基础，使用 Oligo（ dT）对 mRNA 进行反转录的同时，在两端加上通用 linker 引物，利用基因特异性引物，从部分已知的 cDNA 序列扩增其他未知部分的 5端和 3端 7。要扩增带有信号肽序列的鼠抗体可变区基因，即以铰链区与恒
19、定区交界部分为基因特异性引物，利用 5-RACE 技术扩增未知的含信号肽序列的可变区 。许多文献报道已成功利用 RACE-PCR 技术扩增出抗体可变区基因及其信号肽基因 8， 9。2. 2 人抗体恒定区基因的钓取人抗体恒定区基因的钓取要比鼠抗体可变区基因的克隆容易得多，因为恒定区基因非常保守 。在美国国立生物信息中心（ NCBI） 、欧洲生物信息中心（ EBI） 、法国免疫球蛋白基因序列数据库（ IMGT）等数据库中，很容易找到人抗体的恒定区基因序列以及引物 。一般情况下，扩增人抗体恒定区基因应该考虑扩增其内含子区域 。有研究表明，带有天然的或人工合成的内含子序列，有利于维持外源蛋白前体 mR
20、NA 的稳定性，从而提高翻译效率，增加蛋白质的表达 10。有利于内含子剪切的共有序列由 3 部分组成 11 ： 剪接供体（ Splicing donor， SD）： 5-C（ A） A-GGT（ A） AGT-3，位于内含子的 5端与外显子交界处； 剪接受体（ Splicing acceptor, SA）： 5-CAGG-3，位于内含子 3端与外显子交界处； 在内含子受体位点的上游 11 核苷酸处为分支点（ Branch point） T C。然而，带有内含子序列的恒定区基因较长，仅人的CH1 区与 J 区间的内含子长度即达约 1 000 bp，片段过长的抗体基因序列有增加碱基突变的风险，如果
21、突变发生在内含子的剪接处，有可能对抗体的表达造成严重的后果，重链内含子中的未知序列亦可能降低抗体的表达 。因此，对内含子序列的背景不很清楚时，应考虑克隆其 cDNA 序列 。并且，在构建高效表达载体的过程中，由于引入了强启动子 、增强子和相应的表达调控序列，使得嵌合抗体也能高水平表达 。因此，通常以 mRNA 为模板， RT-PCR 扩增抗体恒定区 CH1 CH3 之间的序列 。在选择抗体恒定区的类别时，要有效发挥其生物学功能并延长其在人体内的半衰期 12， 13，通常考虑 IgG1 亚类 型 。2. 3 鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因的拼接许多嵌合抗体的表达载体在构建的过程中，即已连接了
22、人抗体的恒定区基因 14， 15。因此，若要成功克隆出鼠抗体的可变区基因，只需用连接酶将其与表达载体连接即可 。如果表达载体不带有人抗体的恒定区基因，通常利用 SOE-PCR（ Gene splicing byoverlap extention PCR）技术 16，在体外将抗体可变区基因与恒定区基因拼接 。SOE-PCR 是一种简单 、高效而又快捷的方法，目前已广泛应用于基因工程抗体基因的构建中，如嵌合抗体 、单链抗体 、CDR 移植抗体等 。其基本步骤为 17： 分别设计 a、b、c、d 4条引物： a 为嵌合基因的上游引物， d 为嵌合基因的下游引物， b 的 3端序列部分与基因 模板链
23、5端部分序列相同，其 5端序列为基因 模板链 3端部分序列， c 同理，因此引物 b 与 c 可互补； 分别扩增基因 、基因 ，反应产物为 A-B 和 C-D； 将两种纯化产物以合适的比例混合，经变性及退火处理，A-B 链与 C-D 链因部分序列互补而形成杂交链；在 DNA 聚合酶的作用下，形成嵌合基因 A-D 链 。利用 SOE-PCR 技术构建基因工程抗体基因的另一个优势是定点突变 18，可以对表达载体或抗体基因进行改造，以提高载体的表达水平及改善抗体的特异性和亲和力 。在利用 SOE-PCR 方法进行嵌合基因的拼接时，应首选高保真的 DNA 聚合酶 。但许多载体为 T 载体，高保真 DN
24、A 聚合酶并不具备加 “A”尾的能力，通常的解决办法是： 将 Taq 酶与高保真酶按一定比例混合后加入 PCR 反应体系中，如商业化的 Taq Plus DNA Polymerse； 先用高保真酶做 SOE，循环完毕将其置于冰上，补加 0. 7 1 U 的 Taq 聚合酶， 72循环 8 10 min； 用高保真聚合酶进行SOE 后，将纯化产物用专门的加 “A”尾试剂盒进行加 “A”尾； 以基因工程技术对 DNA 聚合酶进行改造，既具备高保真性能又兼有加 “A”尾能力的 DNA聚合酶目前已有产品上市 。2. 4 高效表达载体和宿主细胞的构建嵌合抗体的特异性和亲和力依赖于能否准确获取可变区基因；
25、嵌合抗体的生物学功能又取决于所选择的抗体亚类或型；而嵌合抗体的表达水平主要取决于表达载体和宿主细胞 。目前，基因工程抗体已在多种表达系统中成功表达，对于嵌合抗体，哺乳动物细胞表达系统 19是最佳的选择 。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确空间结构所必需的分子伴侣和折叠酶，其内质网为抗体分子正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化还原环境 。此外，哺乳动物细胞表达系统还拥有完整的转录和转录后 、翻译和翻译后修饰 、信号肽的剪切以及糖基化等优势 20，使表达的抗体空间结构近似于天然，有利于发挥其生物学功能，并延长其在体内的半衰期 。用于抗体表达的哺乳动物细胞有淋巴细胞，如小鼠骨髓瘤系 SP2
26、 0、NS0 和大鼠骨髓瘤系 YB2 0，及非935 中 国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009， Vol. 22 No. 9淋巴细胞，如 CHO、COS、HeLa 细胞等，可根据不同的实验目的和要求，选择不同的宿主细胞 。CHO 细胞因其遗传背景清楚，转染效率高，适用于多种载体表达，可长期稳定传代，并能表达有功能的抗体分子，可用无血清驯化培养及适应性悬浮培养，适于大规模生产 。Page 等 21利用人 -actin 强启动子 、多聚腺苷酸加尾信号以及共扩增基因，使重组抗体在CHO 细胞中的表达量达 20
27、0 g ml。近年来，在生物反应器中，哺乳动物细胞的抗体表达量已经达到每升 “克 ”级的水平 。随着表达载体和细胞工程技术的不断发展以及生产工艺的进一步优化，其表达量仍有提高的潜力 22。嵌合抗体的表达载体是获得功能性抗体高水平表达的关键 。因此，在构建表达载体时，应着重考虑以下几方面： 选择强启动子和增强子 。目前商业化的强启动子有 SV40、人类巨细胞病毒（ hCMV）和EF-1，但是启动子具有组织特异性，并且不同的宿主细胞启动子的转录效率也有差异； 转录终止信号和多聚腺苷酸加尾信号 。强转录终止信号和加尾信号可提高有效 mRNA 的丰度，从而提高抗体的表达水平； 启动子下游的真核内核糖体
28、进入位点（ IRES）对于所有抗体基因的表达都是必需的 。真核的内核糖进入位点通常为 GCCGCCA GCCAUGG+4的共有序列 23； 扩增基因拷贝数的共扩增选择标志 。对于 CHO 细胞，常用二氢叶酸还原酶（ DHFR） 24和谷氨酰胺合成酶（ GS） 25等共扩增基因来提高目的基因的拷贝数； 抗体表达盒的构建 。将轻链 、重链分别构建于不同的表达载体或串联于同一表达载体 。据报道，双顺反子载体不仅可以将轻链 、重链的表达进行偶联，而且还能够提高抗体的表达水平 26；Kozak 序列 。多数真核 mRNAs 包含翻译时结合的亚单位序列 。基因序列中有无 Kozak 序列，其表达水平的差异
29、常常达一个数量级 。脊椎动物通用的Kozak 序列为（ GCC） RCCATGG（ R = A G） 27。3. 展望据预测，到 2010 年，全球的治疗性抗体市场额将达 303 亿美元 28。鼠单克隆抗体因其在体内可产生 HAMA 反应因而在临床应用中受到极大的限制 。随着重组 DNA 技术和蛋白质工程技术的飞速发展，人们可以根据需要对鼠源性单克隆抗体进行改造，以使其广泛应用于临床 。人鼠嵌合抗体作为最早诞生的基因工程抗体，具有其独特的优势：保留有亲本鼠抗体的高特异性和高亲和力；在体内具有较长的半衰期；能有效发挥各种生物学功能；易于操作及成本较低等 。虽然嵌合抗体仍有 30%左右的鼠源性成分
30、，但 90%的 HAMA 反应是针对抗体恒定区的 。有证据表明，嵌合抗体能有效降低人体内的 HAMA 反应，目前，尚无科学数据证明其他基因工程抗体比嵌合抗体更具优势 29。至 2008 年为止，治疗性抗体中主要创造产值的仍然是嵌合抗体 30。准确获取单克隆抗体的可变区基因是维持嵌合抗体特异性和亲和力的关键；选择合适的抗体类别或型是嵌合抗体充分发挥其生物学功能的先决条件；而构建高效的表达载体和宿主细胞是嵌合抗体实现规模化生产以应用于临床的必要前提 。嵌合抗体作为一种较为成熟的基因工程抗体，在分子生物学技术 、细胞工程以及下游纯化等相关技术的驱动下，必将迎来一个崭新的发展阶段 31。参考文献 1
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