1、RT-PCR 实验操作步骤 退火温度：这与你要 PCR 的模板 DNA 有关，不同的模板有不同的最适退火温度。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5。 一.所用试剂1.0.01MPBS 缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌， 40C 保存。临用前 200C 放置 30 分钟，确保冰冷。2.焦碳酸二乙酯(DEPC) ：sigma 公司，40C 保存。3.0.1%DEPC 处理的灭菌去离子水：100ml 去离子水中加入 0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让 DEPC充分进入溶液
2、中，370C 放置过夜，高压蒸汽灭菌 30 分钟除去 DEPC。40C 保存。4.单相细胞裂解试剂 TRizoL：Invitrogen 生命技术公司，40C 保存。临用前200C 放置 30 分钟，确保冰冷。5.氯仿：用新开封的，10ml 分装，40C 保存。临用前200C 放置 30 分钟，确保冰冷。6.异丙醇：用新开封的，20ml 分装，40C 保存。临用前200C 放置 30 分钟，确保冰冷。7.0.1%DEPC 处理的 75乙醇：无水乙醇 75ml 加 0.1%DEPC 处理的灭菌去离子水至 100ml，4C保存。临用前200C 放置 30 分钟，确保冰冷。8.cDNA 反转录试剂盒：
3、MBI 公司，200C 保存。9.2xPCR 试剂：MBI 公司，200C 保存。10.5xTBE RNA 电泳缓冲液：因为 Tris 碱可与 DEPC 发生反应并使之失活，所以含 Tris 碱的电泳缓冲液可用 DEPC 处理的灭菌去离子水配制，0.22um 滤器过滤除菌。室温保存，临用前用 DEPC 处理的灭菌去离子水 10 倍稀释。使用本室 RNA 专用电泳槽，每次需配制 0.5x 电泳缓冲液 500ml。11.50xTAE DNA 电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水 50 倍稀释。使用本室 DNA 专用电泳槽，每次需配制 1x 电泳缓冲液 1000ml。12.6x 上样缓冲液：1.5
4、mlDEPC 处理的灭菌离心管中称取 2.5mg 溴酚蓝，加入 0.3ml 甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至 1ml，40C 保存。13.1.5琼脂糖：RNA 电泳，1.5g 琼脂糖加入 0.5xTBE RNA 电泳缓冲液中;DNA 电泳, 1.5g 琼脂糖加入 1xTAE DNA 电泳缓冲液中。微波炉煮沸熔化后，冷却至 600C 左右，每 100ml 胶加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。14.溴化乙锭（10mg/ml）：在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。15.人淋巴细胞分离液：上海华精生化
5、试剂厂。二.总 RNA 提取注1.本方法采用 Chomczynski 一步法，用单相细胞裂解试剂 TRizoL 破碎细胞和灭活细胞中内源性RNA 酶同步进行，可同时分离 RNA、DNA 和蛋白质。TRizoL 中含有酚、强变性剂硫氰酸狐和溶解剂等。本法所提取的 RNA 可用于 RT-PCR、Northern 印迹杂交等。2.最好单独存放用于 RNA 实验的试剂，以防止污染。3.耐高温的匀浆器、研钵及研棒用锡箔纸包好， 2000C 干烤 5 小时，灭活外源性 RNA 酶。4.离心管、枪头等塑料制品用 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡 12 小时以上灭活外源性 RNA酶。再用去离子水浸泡
6、 10 分钟 x3 次，以去除 DEPC，然后 70-800C 烤干，高压蒸汽灭菌 30 分钟除去残留的 DEPC，以防 DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基进行修饰。5.提取 RNA 所用的去离子水及配制试剂均要经含 0.1%DEPC 处理。 6.如果是从完整包装中新取出的塑料制品，一般无外源性 RNA 酶污染，可以直接使用。7.实验者的双手是外源性 RNA 酶的重要污染源，因此务必戴手套进行操作。8.DEPC 为可疑致癌物，且有芳香性挥发气味，使用时应戴手套、口罩，并打开排气扇。9.RNA 紫外分光光度计定量所用石英比色皿使用后，在 1：1 盐酸甲醇中浸泡 30 分钟以上，再用
7、0.1%DEPC 处理去离子水冲洗干净，凉干。10.用于 RNA 电泳的电泳槽用去污剂清洗干净，自来水冲洗数次，再用去离子水冲洗 1 次，无水乙醇擦洗，干燥。然后灌满 3的双氧水室温放置 10 分钟，最后用 DEPC 处理的去离子水冲洗 3 次。11.提取的 RNA 经琼脂糖凝胶电泳后， 28S rRNA 和 18S rRNA 应当能清楚地在紫外分析仪下看到，也应当能看到一条由 tRNA, 5.8S rRNA 和 5S rRNA 组成的，较模糊迁移较快的带。如果 RNA 没有被降解，28S rRNA 的亮度应当是 18S rRNA 亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物
8、中混有 DNA。(一).培养细胞中 RNA 提取1.贴壁生长的细胞：倒出培养液，加 5ml 无菌冰冷的 PBS 缓冲液冲洗细胞 2 次。倒出 PBS 缓冲液(尽量空干)，加入 1mlTRizoL,用力振荡培养瓶或培养皿(贴壁较牢固的细胞可用细胞刮刀刮取细胞)，使细胞完全脱落，用加样器吹打均匀，吸入 1.5ml 离心管中，漩涡混匀器振荡 30 秒，室温静置 5 分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。悬浮生长的细胞：细胞悬液倒入 10-15ml 离心管，2000 转/ 分离心 10 分钟收集细胞，倒出培养液，加 2ml 无菌冰冷的 PBS 缓冲液，混匀使细胞沉淀重悬洗涤细胞 2 次。再 2000 转/分
9、离心 10 分钟收集细胞，倒出 PBS 缓冲液(尽量空干) ，加入 1mlTRizoL,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml 离心管中，漩涡混匀器振荡 30 秒，室温静置 5 分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。 2.加氯仿 200ul,漩涡混匀器振荡 30 秒，冰盒上静置 10 分钟，3.高速冷冻离心机（温度设定 40C）12000/ 分离心 15 分钟，使混合物分为两相(RNA 留在水相，DNA和蛋白质被抽提进氯仿层)，吸取上层水相 0.5ml 移至一个新的 1.5ml 离心管中，加异丙醇 0.5ml。充分混匀，冰盒上静置 10 分钟，使 RNA 充分沉淀。4.高速冷冻离心机（温度设定 40C）1
10、2000/ 分离心 15 分钟,弃去上清液, 加入冰冷 75%乙醇 1ml 洗涤RNA 沉淀 ,漩涡混匀器振荡 30 秒.5.高速冷冻离心机（温度设定 40C）8000/分离心 5 分钟,弃去上清液,沉淀快速风干。但不要完全干燥这一点非常重要，否则 RNA 沉淀溶解度会大大降低。可通过在 55600C 加热并用枪头反复吹打溶液增加 RNA 的溶解度。6.提取的 RNA 加适量 DEPC 处理去离子水溶解(组织及培养细胞所提 RNA 加水 50100ul 外周血白细胞所提 RNA 加水 1015ul)。取 5ul+1ul6x 电泳上样缓冲液点样，电压 120-130V 电泳 30 分钟左右，如在
11、紫外分析仪下可见 5S、18S 及 28S 三条带出现，说明已提出 RNA。5S 条带较模糊迁移较快。如果 RNA 没有被降解， 28S rRNA 的亮度应当是 18S rRNA 亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有 DNA。RNA 纯度鉴定及定量可用紫外分光光度计，取 2ul148ul 去离子水测 A260nm/280nm，比值应在 1.8-2.0 之间。RNA 浓度(ug/ml)=A260 x 稀释倍数 x40。对大多数细胞株来说，一个 100ml 培养瓶中培养细胞的 RNA 收率为 100200ug 。RNA 原液浓度=A260稀释倍数 40（ng/l）7
12、.如暂时不做反转录，, 立即放-800C 冰箱冻存二).组织中 RNA 提取1.组织收集：新鲜组织立即放入液氮中 30 分钟以上后，可在-800C 冰箱保存，数月内不会影响 RNA 的产量及质量。2.取组织 50-100mg 放入 1ml 玻璃匀浆器中，加入 1mlTRizoL,在冰浴中研磨，悬液转入 1.5ml 离心管中，室温静置 5 分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。高速冷冻离心机（温度设定 40C）12000/ 分离心5 分钟，上清液倒入另一 1.5ml 离心管中。3.以下步骤同培养中细胞 RNA 提取法 (2-7)。(三)外周血白细胞 RNA 提取1.抽取静脉血 5ml,注入 0.5ml
13、 3.8枸橼酸钠（血液：抗凝剂10 ：1 ）的抗凝管中，加盖颠倒混匀2-3 次。2.将上述抗凝血倒入 15ml 离心管中，加 5mlPH7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）等量稀释。3 吸取 5ml 淋巴细胞分离液（上海华精生物技术公司生产）加入另一 15ml 离心管中。4.将稀释后的抗凝血 10ml 沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，水平离心机 2000 转/分离心 20 分钟。5.吸取中间白细胞层至另一 15ml 离心管中，加入 5mlPH7.4PBS 缓冲液混匀（洗涤白细胞），4000转/分离心 5 分钟。弃去上清液，所得白色沉淀即为单个核细胞，如暂时不提取 RNA,立即-800C 冰箱冻存。
14、6.加入 TRizoL(Invitrogen 生命技术公司生产)1ml,用加样器吹打均匀，吸入 1.5ml 离心管中，漩涡混匀器振荡 30 秒，室温静置 5 分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。7.以下步骤同培养中细胞 RNA 提取法(2-7)。三.反转录参见不同厂家试剂盒说明书，以本室使用的 Fermentas MBI 公司 (#K1621)cDNA 反转录两步法试剂盒为例。一步法是将反转录及 PCR 反应的所有试剂加在一个反应体系(EP 管) ，缺点是试剂用量大，反应条件不好掌握；两步法是先反转录，然后进行 PCR 反应。反转录反应（1）在超净台中，取 DEPC 处理的 200lPCR 管置冰
15、上，依次加入总 RNA 1g(2ul)随即引物(0.5g/l) 1l无 RNA 酶水 9ul 至总体积 12l混匀，用微量离心机离心 3000 转/ 分 30 秒。（2）置 PCR 仪上 705 分钟变性，取出置冰上冷却。（3）PCR 管置冰上，依次加入5RT Buffer 4lRNase inhibitor(20U/l) 1l10mM dNTP Mix 2l混匀，用微量离心机离心 3000 转/ 分 30 秒。（4）置 PCR 仪上 255 分钟。取出置冰上冷却。（5）加入 M-MuLV 逆转录酶（200U/l ）1l 至终体积 20l。（6）置 PCR 仪上按以下条件进行25 10 分钟4
16、2 60 分钟70 10 分钟立即冰上冷却，产物 cDNA 即用于 PCR 或置-20冰箱保存。四.PCR 反应（1）取 200IPCR 管依次加入2PCR Master Mix 12.5lcDNA 2.0l上游引物 1l下游引物 1l灭菌去离子水 8.5ul 至 25l用微量离心机离心 3000 转/分 30 秒混匀。（2）按以下条件进行 PCR 反应：94 5 分钟 预变性94 30 秒 变性55-60 45 秒 退火72 45 秒 延伸，共 30-35 个循环72 7 分钟 最终延伸。五.实验对照1.阳性对照：采用已知高表达细胞的总 RNA 进行逆转录和 PCR 扩增。2.阴性对照：用灭
17、菌去离子水代替总 RNA 的反应体系进行逆转录和 PCR 扩增。3.内参照：以引物进行 PCR 反应的同时，以 -actin 引物(或者 GAPDH 引物) 进行 PCR 反应。六.琼脂糖凝胶电泳取内参照扩增产物及 PCR 产物 15ul+3ul 6x 上样缓冲液，同时用相应的 5-8ul DNA Marker,2%琼脂糖凝胶电泳，电压 110-120V，30-45 分钟。七.紫外分析仪观察、数码照相于紫外透视仪下观察有无特异性扩增带，并照相记录。-actin 扩增产物大小 540bp，340 bp。GAPDH 扩增产物大小 142bp。在 ddH2O 中加入 0.1的 DEPC，用搅拌子搅拌
18、 2 小时，使 DEPC 充分溶解在水里。然后将 EP 管,tip 头及大离心管 etc 浸入以上水中，后放入 37 度培养箱中过夜，第二天倒掉液体后高压。 （不是仅仅 DEPC 处理的水冲洗就可以的） 。DEPC 处理的水我们不重复使用。 经 DEPC 处理好的东西如 EP 管,应先在 70-80 度烤干后，再高压;剪刀 玻璃制品可以用 DEPC 处理后 180-200 度干烤 2 小时酶活力单位酶活力的度量单位。1961 年国际酶学会议规定：1 个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在 1 分钟内能转化 1 微摩尔底物的酶量，或是转化底物中 1 微摩尔的有关基团的酶量。Po
19、lyclar-AT is insoluble PVP, also called as PVPP (PolyVinylPolyPyrrolidine). It binds phenols etc more efficiently than PVP and is easily removable by filtration or a low speed spin.关于 HEPES 缓冲溶液的配制，不同的文献资料有不同的说法。根据用途，一种是单纯的 HEPESNaOH，另一种是 HEPES盐。各种配制方法总结如下：一、500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution
20、的配制119.15 g HEPES 溶解在 400ml 蒸馏水中，加 0.51M 的 NaOH 水溶液调节至少所需 pH（HEPES 的有效 pH 范围是 6.88.2） ，然后用蒸馏水定容至 500ml，于 4 摄氏度保存。二、加少量盐的 HEPES Buffer 配方（500ml ）HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用 0.5M NaOH 水溶液调节 pH 值，最后定容。三、2HEPES 缓冲盐溶液的配制将 1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g 葡聚糖(glucan ordextran)和
21、 1g HEPES 溶解在 90ml 的蒸馏水，用0.5MNaOH 调节至所需 pH 值，再用蒸馏水定容至 100ml 即可。DTT 即 DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为 C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度99%。 常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT 和巯基乙醇相比，作用相似，但 DTT 的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且 DTT 比巯基乙醇的浓度低 7 倍时，两者效果相近。但 DTT 价格略高一些。megabecquerels 兆贝可勒尔(放射性强度单位)放射性是延须知:(1) 放射性实验室自我检查及防护 (2) 放射性实验
22、应急措施 (3) 放射性化合物的贮存和使用: 放射性物质有两种分解方式,化学分解和放射性衰变引起的诱发分解. (4) 放射性强度(或放射性活度 ) (5) 比活度 (6) 放射性单位换算 (7) 文献资料 (1) 放射性实验室自我检查及防护 1） 做放射性实验之前，必须戴双层一次性塑料手套 2） 如果发现或感觉到有放射性物质污染手套，应立即退下一层塑料手套 3） 尽量减少放射性物质直接暴露于空气的时间。用完以后，应立即盖上试剂瓶 4） 做完放射性实验以后，用擦拭法检查做实验过程中用过的实验台，地板和仪器，一般检查 6 至 10 个点 5） 擦拭检查的草纸放在塑料小管中，加入液体闪烁液 6） 用
23、 MicroBeta 仪测量各个检查点的放射性浓度 7） 注意: 低放射性元素, 如氚和碳 14, 塑料手套和皮肤足以阻挡 beta 射线, 无需额外保护装置 (2) 放射性实验应急措施 1） 如果发现有放射性物质溢漏，应首先界定范围 2） 如果是在衣服和鞋袜上，应立即脱掉有污染的衣服和鞋袜，然后用草纸吸收和收集液体和固体的放射性物质。所有放射性垃圾应放入专门的垃圾箱中。 3） 被污染的皮肤在用草纸清洁以后，用湿的草纸再擦洗一遍，然后再用肥皂擦洗。 4） 如果放射性物质在地板或实验台上，应先用草纸吸收和收集液体和固体的放射性物质。5） 然后用乙醇和草纸擦洗污染地点。 6） 清洗完毕以后，用擦拭
24、法检查污染地点是否还有放射性物质 7） 如果还有，必需继续清洗，直到没有为止。 8） 清洗结束以后，必须报告污染经过给实验负责人。 (3) 放射性化合物的贮存和使用: 放射性物质有两种分解方式,化学分解和放射性衰变引起的诱发分解. 1) 从供应商处取货后, 一般存放在至少 -20C 的冰箱, 最好在-70C. 2) 在做实验之前, 确定大致实验需要与进度 , 对放射性化合物进行分装. 3) 每次只需要从低温冰箱取一支分装的放射性化合物. 4) 控制每支分装样品, 解冻复冻次数小于 5 次. (4) 放射性强度(或放射性活度 ) 放射性同位素不断地衰变，它在单位时间内发生衰变的原子数目叫做放射性
25、强度（radioactivity） . 放射性同位素衰变值的计算: A=Aoe(-lt); l = (ln2)/T1/2; T1/2 为半衰期 ; Ao 己知源强度 ; A 是经过时间 t 后的强度. 在国际单位制（SI）中，放射性强度单位用贝柯勒尔（becquerel）表示，简称贝可，为 1秒钟内发生一次核衰变，符号为 Bq。 因为这单位太小, 所以有: 1KBq = 10(3) Bq; 1MBq = 10(6) Bq; 1GBq = 10(9) Bq. 放射性强度的常用单位是居里（curie） ，表示在 1 秒钟内发生 3.710(10)次核衰变，符号为 Ci。 1 居里(Ci) = 3.
26、710(10) Bq = 37 GBq 1 毫居(mCi) = 3.710(7) Bq = 37 MBq 1 微居(Ci) = 3.710(4) Bq = 37 KBq 1 分钟内发生的核衰变次数，符号为 dpm (decay per minute). 1 Bq = 1 dps = 60 dpm 1 居里(Ci) = 3.710(10) dps = 2.22 10(12) dpm 1 毫居(mCi) = 3.710(7) dps = 2.22 10(9) dpm 1 微居(Ci) = 3.710(4) dps = 2.22 10(6) dpm (5) 比活度 比活度是单位质量（固体）或体积（液
27、体气体）的活度。 活度是单位时间内放射性元素衰变的次数。 当这种核素的丰度是 100时，它的比活度就是本征比活度。 比活度是最终产品的比活度，这个比活度值和活度值一样，不同时间是不同的，随着时间衰变。时间对长寿命同位素如氚, 碳 14 影响不大. 比活度的单位, 常见的有: Ci/mmol; Ci/mol; Ci/g; 等等. 放射性比活度的测定方法是： 1) 用活度计测定放射性活度，从而计算出放射性浓度。 2) 用分析 HPLC 做产品取样分析，进样量要准确，用色谱的定量测定方法测出待测物质的物质的量（mol） 。 3) 由放射性浓度和进样体积计算出进样活度，除以刚才测出的物质的量, 就是这
28、种药物在放射性活度标定时间的比活度。 (注意: 这两者所用为同一数量的样品, 如不一样, 通过换算也可以) (6) 放射性单位换算 公式和换算 1 Curie (Ci) = 2.22 x 10(12) disintegrations/min (dpm) = 37 GBq 1 mCi = 2.22 x 10+9 dpm = 37 MBq 1 Ci = 2.22 x 10+6 dpm = 3.7 X 10+4 Bq = 37 kBq 1 Becquerel (Bq) = 1 disintegration/s (dps) = 2.7 x 10-11 Ci = 2.7 x 10-5 Ci 1 GBq
29、= 27 mCi 1 MBq = 27 Ci 1 kBq = 27 nCi Radioactive decay equation A=Aoe-( 0.693t/T1/2 ) Ao- original activity T1/2 - half-life t - elapsed time System International (SI) Units for Ionizing Radiation Activity, Becquerel (Bq) = Disintegrations/sec 1 Bq = 2.7 x 10-11 Ci Absorbed Dose, Gray (Gy) = Joule/
30、kilogram 1 Gy = 100 rads Dose Equivalent, Sievert (Sv) = Joule/kilogram 1 Sv = 100 rems (7) 文献资料 (1) 辐射安全 (a) 国家电离辐射防护与辐射源安全基本标准 (b) 关于辐射安全地使用放射性同位素专著放射性保护 (2) 高压液相溶剂选择 控制 HPLC 溶剂的 pH (3) 测定结合常数 Thrombin Receptor Hydroxysteroid Dehydrogenase (4) 同位素示K-Pi Buffer (pH 7.8 100mM)K2HPO43H2O 2.28g+ddH2O10
31、0ml 取出 46.8ml KH2PO4 1.36g+ddH2O100ml 取出 3.2ml由 C18 对水溶性基质中大多数的有机物质都具有保留性能，因此 C18 选择性最小，常被用来处理含有多种结构或是结构相差很大的分析物样品。由于 C18 的长链效应，填料的极性作用比其它吸附剂都小，通常可以用 C18 小柱代替离子交换柱对一些小分子和一些中等大小分子脱盐，因为 C18 填料对盐没有任何保 留。主要用于反相萃取，适合于非极性到中等极性的化合物，如抗菌素、巴 比妥酸盐、酞嗪、咖啡因、药物、染料、芳香油、脂溶性维生素、杀真菌 剂、除草剂、环境农药、PAH 和 PCB 残留、食品添加剂、碳水化合物
32、、对羟基 甲苯酸取代脂、苯酚、邻苯二甲酸酯、类固醇、表活化剂、茶碱、水溶性维 生素。 固相萃取小柱的使用方法一般包括：活化、过柱、洗脱三步。首先，用活化剂将柱子活化，以增强柱子对目标物的吸附；第二步：过柱，将样品溶液注入固相萃取小柱，加压或其他方式使样品通过小柱，目标物吸附。第三步，洗脱，用洗脱液将吸附在固相萃取柱上的目标物洗脱下来，就可以检测了。以前做黄芪注射液指纹图谱时用过 C18 小柱，每次实验结束后，我都会将使用过的小柱浸泡在甲醇溶液中。小柱可以重复使用至少 3 次ctab 即十六烷基三甲基溴化胺，别名溴化十六烷基三甲基胺,鲸腊基三甲基溴化胺，分子式 c19h42nbr，理化性质为白色
33、或黄色膏体或固体粉末,有刺激气味.熔点 32,hlb 值 15.8,熔于热水、乙醇、三氯甲烷 ,易熔于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于醚.加热至多 24.525.2分解。有良好的表面活性、稳定性、杀菌性及生物降解性。在强酸及强碱中穏定,耐热、耐光。与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配伍性,对多种油脂具较好的乳化作用.对皮肤及粘膜刺激性小,有轻微脱脂作用。是一种阳离子去污剂，广泛用于润湿、杀菌、抗静电、去污、增溶等方面。可用作纤维高效抗静电剂。工业及油田水处理中用作杀菌灭藻剂、粘泥剥离剂。牙膏中用作口腔杀菌剂。用于香波及护发素,可使头发易于梳理、光滑、柔软。还右用作矿物浮选剂、电镀液缓蚀剂、沥
34、青乳化剂、硬表面清洗剂及有机合成相转移催化剂等。还具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，ctab 与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，ctab 可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌PEG 是聚乙二醇英文名 polyethylene glycol 的简称，一种化学药品，被广泛的应用于化妆品行业。Tris：三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为 Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HO
35、CH2)3CNH2。分子式: (HOCH2)3CNH2 分子量.: 121.14Tris 被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的 TAE 和 TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到 Tris。由于它含有氨基因此可以与醛发生缩合反应Tris 为弱碱，在室温（25下，它的 pKa 为 8.1；根据缓冲理论， Tris 缓冲液的有效缓冲范围在 pH7.0 到 9.2 之间。Tris 碱的水溶液 pH 在 10.5 左右，一般加入盐酸以调节 pH 值至所需值，即可获得该 pH 值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris 的 pKa 的影响。由于 Tris
36、 缓冲液为弱碱性溶液，DNA 在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在 Tris 盐酸缓冲液中加入 EDTA 制成“TE 缓冲液” ，TE 缓冲液被用于DNA 的稳定和储存。如果将调节 pH 值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE 缓冲液”（Tris/Acetate/EDTA） ，而换成硼酸则获得“TBE 缓冲液 ”（Tris/Borate/EDTA ） 。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。5Tris-硼酸（TBE）缓冲液 成分及终浓度 配制 1L 溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐 10 mmol/L EDTA 水 54g 27.5
37、g 硼酸 20 ml 的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足 1L 1 Rnase 是一种蛋白酶，能够降解 RNA。2 我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被 RNA病毒感染？或者什么的。3 这个酶高效稳定。要么在 DEPC 水中处理 n 小时，要么在 160 度高温烘烤 6 小时。此酶才会失效。4 所谓 DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓 DEPC 水，一般指两种状态，a，配制 好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。1 无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌 4 小时以上至完全
38、溶解，高压灭菌 20 分钟，冷却备用。这个是 DEPC 水的 b 状态。2 如果你要用 DEPC 水处理 Tips 等等东东，那么就要用高压前的水，即 DEPC 水的 a 状态。把枪头管子等完全浸泡至少 8 小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。RNA 提取必须创造无 RNase 的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在 180烘干 4h 以上； 电泳槽、胶板、梳子、用 0.1 %0.2%DEPC 水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用 0.5%的 SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制 RNase 的活性)浸泡过夜，然后用
39、ddH2O 冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用 0.1%0.2%DEPC 水处理之后(DEPC 有致癌之嫌，须小心操作)。37保温 12h 以上，然后高压灭菌，灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经 DEPC 处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。 我们研究所里提 RNA 用的枪头和 EP 管都是高压两遍的，没有用 DEPC 水处理。1、 有灭菌过的 DEPC 水，这一般是用来配 75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。2、 没有经高压灭菌的 DEPC 水，这主要是用于配你提 RNA 所用的其他
40、试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除 DEPC，以防止它以随后实验的干扰。3、 DEPC 处理水：无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌 4 小时以上，121 度高压灭菌 20 分钟，冷却备用。 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理,加入 DEPC 至 0.1%浓度,
41、然后剧烈振荡 10 分钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC,否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而含 Tris 和DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂. 为啥在 28s 之后还是有影影约约的片断？和模糊的 smear？这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就
42、一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。电泳时间太长了容易产生降解。最好是在 120V 左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响 RNA 的质量。无论你是提什么 RNA 只要是用异丙醇沉淀的，都得用 75的酒精洗涤一次。1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置 5min；2 200ul 氯仿 剧烈振荡 20s，室温放置 215min；3 13000g 离心 15min;4 取上层水相,一般 400-450ul 就足够了，千万不要贪多！*5 加入 500ul 异丙醇 摇匀，室温放置 10min； 6 12000g 离
43、心 10min；7 75乙醇 1000ul 洗涤沉淀；8 7500g 离心 5min；（12000 转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥 35min；（时间太久沉淀不易溶解）10 适量 DEPC 水溶解沉淀。电泳的上样量 1ug，电泳 buffer 用 DEPC 处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，1015min 足够了。建议跑 RNA 电泳。先用 2琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入 RNA 酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的 RNA 亮度 。28S:18S 应为 2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有
44、带， 若有，可能为基因组 DNA 污染。 OD 值只有 1.5，可能为基因组 DNA 污染。参考一下分子克隆 3。上面有 OD 值与 污染 DNA 的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的 RNA 样品可用无 RNA 酶的 DNA 酶消化一下。注意该酶的 buffer 中有一种物质在 OD260 有吸光度，应严格按照其 protocol 操作，减少误差。 配 1000ml 的 DEPC 处理水，加 1mlDEPC。 磁力搅拌器搅拌 过夜 。第二天 高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC 分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。 搞一次也不容易DN
45、A 的碱基数大于 5000bp 而 RNA 一般只有 28s 条带和 18s 条带可见,它们的碱基数在600bp 到 5000bp 之间且 28s 的亮度大概是 18s 的 1.5 倍,5s 一般看不到RNA 的琼脂糖凝胶电泳而且 28S 为 5000kb 左右，18S 为 2000Kb 少一点RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用 1.0%-1.4%的凝胶，不同的 RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通
46、的 1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总 RNA 溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液，0.5g/ml 溴化乙锭（EB）10X 载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用 1TAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA 样品 4l 于封口膜上。在实验台上再加入 5l 1TAE 电泳缓冲液及 1l 的 10X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA 由负极向正极电泳，约 30min 后将凝胶放
47、入 EB 染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。RNA 的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS 缓冲液（10* ）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料： 50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。v 电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H 2O2 灌满室温放置 10 分钟0.1%DEPC 水冲洗。操作： （1） 将制胶用具用 70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖凝胶。 称取 0.5g 琼脂糖
48、，置干净的 100ml 锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 待胶凉至 60-70 ，依次向其中加入 9ml 甲醛、5ml 10X MOPS 缓冲液和 0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。 灌制琼脂糖凝胶。 （3 ） 样品准备： 取 DEPC 处理过的 500ul 小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS 缓冲液 2ul，甲醛 3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品4.5ul,混匀。 将离心管置于 60水浴中保 10 分钟，再置冰上 2 分钟。 向管中加入 3ul 上样染料，混匀。（4）上样。 （5）电泳：电泳槽内加入 1XMOPS 缓冲液，于 7.5V/ml 的电压下电泳。 （6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。做如何用 DEPC 处理 EP 管和枪头呢？是不是 EP 管放在一个大烧杯里，加入 0.1%的 DEPC 水，封口，37 度过夜浸泡，之后放到高压灭菌锅里高压两次，每次一小时，然后打开封口，倒掉水，再高压一次，然后烘干？感觉有点不太对劲啊灭一次菌就可以了，但要单独灭菌，盒子也要用 DEPC 水处理，盒子各枪头各灭菌，枪头一般放在铝饭盒里灭菌，用时再放到枪头盒中。电泳缓冲液也都要用 DEPC 处理的水来配制（
