1、实验一 实验动物的一般操作技术一、实验目的学习食品毒理学试验中有关动物试验的基本操作技术，掌握实验动物的选择，性别鉴定，抓取方法，标记方法，染毒方法，生物材料采集和实验动物处死等技术。二、器材与试剂苦味酸酒精饱和溶液、美蓝溶液、0.9的 NaCl 溶液托盘天平、电子天平、棉签、1mL 注射器、灌胃器、烧杯、容量瓶、定量取血管、玻璃毛细管、鼠笼昆明种小鼠三、操作方法（一） 实验动物的选择食品毒理学研究中，无论应用何种种属、品系的实验动物，都必须是健康动物。动物的选择，应重点检查下述项目。1. 外观 体形丰满，被毛浓密光顺，行动敏捷，反应灵活。2. 眼睛 明亮，瞳孔清晰，双侧等圆，眼内无分泌物，眼
2、睑无肿胀、发红。3. 耳 耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮、糜烂。4. 鼻 无喷嚏，无浆性黏液分泌物。5. 皮肤 无创伤、脓疮、疥癣、湿疹。6. 头颈部 姿势端正。颈项歪斜提示可能存在内耳疾患，不能用于实验。7. 消化道 无呕吐、便秘、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。8. 神经系统 无震颤、麻痹、运动失调，如有转圈运动或倒提时呈圆圈摆动，不能用于实验。9. 四肢及尾 四肢、趾及尾无红肿、溃疡。10.食欲及营养 良好（二） 实验动物的性别鉴定1. 大鼠、小鼠 主要观察肛门与生殖孔的间距，雄性间距大，而雌性间距小；雄鼠夏天或卧位可见睾丸，雌鼠腹部有明显乳头，大鼠 6 对，小鼠 5 对。（三） 实验动
3、物的抓取和固定实验前应了解动物的一般习性，正确抓取和固定动物，既要大胆，又要细心。1. 小鼠的抓取方法 先用右手抓取鼠尾部提起，置于实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓取小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手手心中，以无名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。右手则可进行灌胃或注射等操作。（四） 实验动物的称重、编号和标记1. 称重 一般同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的 10，组间同性别动物体重平均值相差应小于 5。2. 编号和标记（1） 染色法 一般采用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位的被毛染色，表示不同号码，此法适用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用的染料有苦味酸酒精饱和液（黄色
4、） 、美蓝溶液（蓝色）或甲基紫酒精饱和液、0.5中性红或品红溶液（红色）等。具体方法为：头部为 1 号，按顺时针方向，右前肢 2 号、右肋 3 号、右后肢 4 号、尾跟 5 号、左后肢 6 号、左肋 7 号、左前肢 8 号、背部 9 号；在相应部位涂染另一种颜色染料表示十位，两种颜色可编 199 号。（五） 实验动物的染毒途径和方法1. 经口染毒（1） 灌胃 将毒物不经口腔和食道，直接灌入胃内。急性毒性试验多用此法。具体方法：用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部。将动物固定成垂直体位，腹部
5、面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。进针深度一般是小鼠 2.5cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。（2） 喂饲 将受试化学物均匀拌入饲料或溶于饮水中，由动物自由采食。适用于染毒时间较长的毒性试验，如亚慢性和慢性毒性试验。（3） 吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入胶囊内，强制动物咽下。适用于
6、易挥发、易水解和有异味的化学物，兔、犬、猫可用此法。2注射染毒 外源化学物的毒性研究中，根据试验目的和需要，可选择腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等途径染毒。大鼠和小鼠经尾静脉注射，兔则经耳静脉注射。（六） 实验动物生物材料的采集和制备毒理学研究中，常常需要采集动物的血液、尿液或组织，测定外源化学物或其代谢物的浓度。因此，生物材料的采集和制备是毒理学研究重要的基本操作技术。1大、小鼠采血（1）鼠尾采血。 适用于用血量较少的试验。固定动物后，将鼠尾浸入 4550温水，使尾静脉充血，擦干，用酒精棉球消毒。将尾尖剪去约 23mm, 拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管内加抗凝剂与否，依试验需要而定
7、）吸取定量尾血，然后用干棉球压迫止血。如需要多次采血，可用火棉胶涂封，下次采血时去掉火绵胶。鼠尾采血亦可用 1ml 注射器连接56 号针头直接刺入尾静脉定量采血。（2）断头采血。操作者一手握住动物，另一手持剪刀或断头钳快速断头，倒立动物将血液滴入容器，注意防止断毛落入容器中。用于大鼠、小鼠。（3）摘眼球采血。动物倒立，使眼球外突充血，用小镊迅速摘掉眼球，将血液滴入事先备好的容器内。此法用于鼠类大量采血，仅使用一次。（七） 实验动物的处死方法1. 颈椎脱臼法 多用于小鼠，一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎脱臼，立即死亡。2. 断头法 用于大鼠和小鼠。保定者一手按住鼠头，另一手握住
8、背部，露出颈部，助手持大剪刀或断头器剪断颈部，使之死亡。此法不引起血浆皮质酮、儿茶酚胺升高，常用于血液及化学成分、组织酶测定。3. 击打法 适用于较小的动物。抓住鼠尾、提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡；也可用器具击打动物头部，使其致死。前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。4. 其他 电击法、枪击法、微波法等。动物处死方法多种多样，原则是根据实验需要进行选择，同时尽量消除动物在试验过程中所致的疼痛和不适，遵守动物试验的职业道德。四、作业注明自己所选择实验动物的性别、体重及编号（画图说明）实验二 小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE ）微核测定
9、方法。二、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在干细胞中主核之外的一种颗粒大小相当于细胞直径的 1/20-1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受到影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于 PCE 细胞中，因此通常计数 P
10、CE 细胞中的微核。三、器材与试剂1器材 手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml 注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。2试剂 甲醇（分析纯） 、甘油（分析纯） 、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备液（取 Giemsa 染料，甘油 66ml ，甲醇 60ml 。先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾入剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置 60 水浴 2h ，取出待冷却后加入甲醇，混合静置 2 周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的
11、时间越长，染色效果越好。临用时用 pH6.8 磷酸盐缓冲液配制为 10的应用液、pH 6.8 的磷酸盐缓冲液。3阳性对照物 环磷酰胺。四、操作步骤1试验动物及处理(l）动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重 18 g , 7-12 周龄。每组小鼠数量 5 只，雌雄各半。(2)染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与入体接触化学毒物相同的途径。(3）染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。波动范围可以达到 24 -72h。这就要求在接触化学毒物后设
12、立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以 4 次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续 4 天，第 5 天取样。(4）剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情况下，应设 3-5 个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到 3 个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（40mg/kg）腹腔注射 1 次或 2 次。阴性对照组用等体积的溶剂。2骨髓液的制备和涂片试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，用小型弯
13、止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上 , 混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨髓，取骨髓滴在清洁的载玻片上，推片。阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。3固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定 15min，取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。4染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Giemsa 应用液（Giemsa 储备液 l 份加 pH6.8 的磷酸盐缓冲液 9 份）染色 10 - 15min ，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干5观察计数先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较
14、好的区域，再在油镜下观察计数PCE 细胞呈灰蓝色，正染红细胞（ NCE ）呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数 1000 个 PCE 中含微核的 PCE 数，并且计数 200 个细胞中 PCE 与 NCE 的比值。五、结果分析与评价每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核 PCE 的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的 PCE/NCE 比值约为 1（正常范围为 0.6-1.2） 。如比值0. 01，则表示 PCE 形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大
15、，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。六、作业计数 PCE 中的微核，微核率以千分率表示，并简要分析阴性对照组和阳性对照组的微核发生率不同的原因。实验二补充内容 细菌回复突变试验1 范围细菌回复突变试验包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和大肠杆菌细菌回复突变试验。本标准主要规定鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求，选择大肠杆菌进行细菌回复突变试验时应参阅有关文献。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理
16、因素的致突变作用，检验对象包括食品及其食品原料、食品添加剂、新资源食品、辐照食品、食品相关产品(用于食品的包装材料、容器、洗涤剂和用于食品生产经营的工具、设备)以及食品污染物。2 术语和定义2.1 细菌回复突变试验细菌回复突变试验是以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。2.2 碱基取代型基因突变 指 DNA 多核苷酸链上某个碱基为另一个碱基取代，引起 DNA 碱基序列异常。2.3 移码型基因突变指在 DNA 碱基序列中插入或缺失了一个或几个（除了 3 和 3 的倍数）碱基，于是按三联密码连续阅读的规则，
17、该部位以后的密码子组成全部改变，指导合成的多肽链也全部发生改变。3 原理/实验目的检测受试物对微生物（细菌）的基因突变作用，预测其遗传毒性和潜在的致癌作用。细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及 DNA 的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的试验菌株分别为组氨酸缺陷突变型和色氨酸缺陷突变型，他们在无组氨酸或色氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸或色氨酸的培养基上才能正常生长。致突变物存在时可以回复突变为原养型，在无组氨酸或色氨酸的培养基上也可以生长。故可根据菌落形成数量来衡量受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使上述细菌产生回复突
18、变，受试物要同时在有和没有代谢活化系统的条件下进行试验。4 仪器和试剂4.1 仪器实验室常用设备、低温高速离心机、低温冰箱（-80）或液氮罐、生物安全柜、恒温培养箱、恒温水浴、灭菌设备、匀浆器等。4.2 试剂培养基成分或试剂除特殊说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于 4不超过六个月，其它详见下述各培养基及溶液内容。4.2.1 营养肉汤培养基牛肉膏 2.5g，胰蛋白胨 5.0g，氯化钠 2.5g，磷酸氢二钾（K 2HPO4.3H2O）1.3g，加蒸馏水至 500mL，加热溶解，调 pH 值至 7.4，分装后 0.103 MPa 20min 灭菌，
19、普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。4.2.2 营养肉汤琼脂培养基琼脂粉 1.5g，加营养肉汤培养基至 100mL，加热融化后调节 pH 为 7.4，0.103 MPa 20min 灭菌。4.2.3 底层培养基在 400mL 灭菌的 1.5琼脂培养基（100 ）中依次加入磷酸盐贮备液 8mL, 40葡萄糖溶液 20mL，充分混匀，待凉至 80 左右时用于倒平皿。每平皿按 25mL（相对于 90mm 平皿）制备平板，冷凝固化后倒置于 37 培养箱中 24 小时，备用。磷酸盐贮备液、40葡萄糖溶液和 1.5琼脂培养基配方如下：4.2.3.1 磷酸盐贮备液(Vogel-Bonner minimal
20、medium E, 50)磷酸氢钠铵（NaNH 4HPO44H2O）17.5g，柠檬酸（C 6H8O7H2O） 10.0g，磷酸氢二钾（K 2HPO4） 50.0g，硫酸镁（MgSO 47H2O） 1.0g，加蒸馏水至 100mL 溶解（注：待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则容易析出沉淀） ，0.103 Mpa 20min 灭菌。4.2.3.2 40%葡萄糖溶液葡萄糖 40.0g 加蒸馏水至 100mL，0.055 MPa 20min 灭菌。4.2.3.3 1.5琼脂培养基称琼脂粉 6.0g 加入 400 mL 三角瓶，加蒸馏水至 400 mL，融化后，0.103 MPa
21、 20min 灭菌。4.2.4 顶层培养基加热融化顶层琼脂，每 100 mL 顶层琼脂中加 10mL 0.5 mmol/L 组氨酸生物素溶液。混匀，分装在 4 个烧瓶中，0.103 MPa 20min 灭菌。用时融化分装小试管，每管 2mL，45水浴中保温。顶层琼脂和 0.5 mmol/L 组氨酸生物素溶液配制如下。4.2.4.1 顶层琼脂称琼脂粉 3.0 g，氯化钠 2.5 g 加蒸馏水至 500 mL，0.103 MPa 20min 灭菌。4.2.4.2 0.5 mmol/L 组氨酸生物素溶液（诱变试验用）称 D-生物素（分子量 244）30.5 mg 和 L-组氨酸（分子量 155）19
22、.4 mg 加蒸馏水至 250 mL，0.103 MPa 20min 灭菌。4.2.5 特殊试剂及培养基4.2.5.1 0.8氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）氨苄青霉素 40 mg 用 0.02 mol/L 氢氧化钠溶液稀释至 5 mL，保存于冰箱。4.2.5.2 0.1结晶紫溶液（鉴定菌株用）100 mg 结晶紫，溶于无菌水至 100 mL。4.2.5.3 L-组氨酸溶液和 0.5 mmol/L D-生物素溶液（鉴定菌株用）L-组氨酸 0.4043 g 和 D-生物素 12.2mg 分别溶于蒸馏水至 100mL，0.103 Mpa 20min 灭菌，保存于 4冰箱。4.2.5.4 0.
23、8四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板）40 mg 四环素用 0.02 mol/L 盐酸缓冲液稀释至 5 mL，保存于 4冰箱。4.2.5.5 氨苄青霉素平板（用作 TA97、TA98、TA100 菌株的主平板）和氨苄青霉素四环素平板（用作 TA102 菌株的主平板）每 1000 mL 中由以下成分组成底层培养基 980 mL，组氨酸水溶液（0.4043g/100mL）10 mL，0.5 mmol/L 生物素 6 mL，0.8氨苄青霉素溶液 3.15 mL，0.8四环素溶液 0.25 mL，四环素仅在使用对四环素有抗性的 TA102 时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。4
24、.2.5.6 组氨酸生物素平板（组氨酸需要试验用）每 1000mL 中由以下成分组成：底层培养基 984mL，组氨酸水溶液（0.4043/100mL） 10mL，0.5mmol/L 生物素 6mL，以上成分均已分别灭菌。4.2.5.7 二甲亚砜（DMSO）：光谱纯，无菌。4.2.6 阳性诱变剂的配制根据所选择的诱变剂的种类和剂量用适当的溶剂配制阳性对照品（见附录 B、C） 。4.3 10% S9 混合液的制备10% S9 混合液由 S9 组分和 S9 辅助因子以适当比例组成，用作试验中的活化系统。4.3.1 S9 辅助因子的配制4.3.1.1 镁钾溶液氯化镁 1.9 g 和氯化钾 6.15 g
25、 加蒸馏水溶解至 100 mL。4.3.1.2 0.2 mol/ L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）磷酸氢二钠（Na 2HPO4, 28.4g/L）440 mL，磷酸二氢钠（NaH 2PO4H2O, 27.6g/L）60 mL，调 pH 至 7.4，0.103 MPa 20min 灭菌或滤菌。4.3.1.3 辅酶-（氧化型）溶液无菌条件下称取辅酶-，用无菌蒸馏水溶解配制成 0.025 mol/L 溶液，现用现配。4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液无菌条件下称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成 0.05 mol/L，现用现配。4.3.2 大鼠肝 S9 组分的诱导和配制选健康雄性成
26、年 SD 或 Wistar 大鼠，体重 150200 g 左右，周龄约 56 周。将多氯联苯（Aroclor1254）溶于玉米油中，浓度为 200g/L，按 500 mg/kg BW 无菌操作一次腹腔注射，5 天后处死动物，处死前禁食 12h。也可采用苯巴比妥钠和 -萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和 -萘黄酮，剂量均为 80mg/kg，连续 3 天，禁食 16h 后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的 0.15 mol/L 氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加 0.1 mol/L 氯
27、化钾溶液 3 mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于 4000 r/min，往复 12 min）或组织匀浆器（低于 20000 r/min，1 min）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温（0 4 ）高速离心机上以 9000 g 离心 10 min，吸出上清液为 S9 组分，分装于无菌冷冻管或安瓿中，每安瓿 2 mL 左右，最好用液氮或干冰速冻后置 -80 低温保存。S9 组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Lowry 法） ，每毫升蛋白含量不超过 40mg为宜，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期
28、不超过一年。4.3.3 10% S9 混合液的制备一般由 S9 组分和辅助因子按 1：9 组成 10%的 S9 混合液，也可将浓度配制成 30（不同受试物所需 S9 浓度不同） ，临用时新鲜无菌配制，或过滤除菌。10 S9 混合液 10mL 配制如下：取上述：磷酸盐缓冲液 6.0 mL，镁钾溶液 0.4 mL葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液 1.0 mL，辅酶-溶液 1.6 mL，肝 S9 组分 1.0 mL，混匀，置冰浴中待用。用每皿 0.5 mL S9 混合液（含 20L 50 L S9）测定其对已知阳性致癌物（诱变剂）的生物活性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平皿 0.5 mL S9 混合液
29、。5 菌株及其鉴定与保存5.1 试验菌株 5.1.1 推荐菌株组合 1推荐采用下列的菌株组合：a） 鼠伤寒沙门氏菌 TA1535； b） 鼠伤寒沙门氏菌 TA97a 或 TA97 或 TA1537； c） 鼠伤寒沙门氏菌 TA98； d） 鼠伤寒沙门氏菌 TA100； e) 鼠伤寒沙门氏菌 TA102 或大肠杆菌 WP2uvrA 或大肠杆菌 WP2uvrA(PKM101)。5.1.2 推荐菌株组合 2可采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 TA97、TA98、TA100 和 TA102。5.2 菌株的鉴定5.2.1 总则菌株特性应与回复突变试验标准相符。菌株的鉴定包括：基因型鉴定、自发回变数鉴定和
30、对阳性致突变物敏感性的鉴定。每 3 个月进行一次菌株鉴定，遇到下列情况也应进行菌株鉴定：a) 在收到培养菌株后；b) 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时；c) 重新挑选菌株时；d) 使用主平板传代时；5.2.2 鉴定方法5.2.2.1 增菌培养在 5 mL 营养肉汤培养基中用接种环接种贮存菌培养物，37 振荡（100 次/min）培养10 小时或静置培养 16 小时，使活菌数不少于 1210 9/mL。5.2.2.2 组氨酸缺陷型（his）的鉴定5.2.2.2.1 底层培养皿的制备加热融化底层培养基两瓶。一瓶不加组氨酸，每 100 mL 底层培养基中加 0.5 mmol 分子D-生物素 0
31、.6 mL；另一瓶加组氨酸，每 100mL 底层培养基中加 L-组氨酸 1 mL 和 0.5 mmol分子 D-生物素 0.6mL。冷却至 50左右，每种底层培养基各倒两个平皿。5.2.2.2.2 接种取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表面，37 培养 48 小时。5.2.2.2.3 结果判定四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，在无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。5.2.2.3 脂多糖屏障缺陷（rfa）的鉴定5.2.2.3.1 接种加热融化营养肉汤琼脂培养基。取菌液 0.1 mL 移入平皿，迅速将
32、营养肉汤琼脂培养基（冷却至 50左右）适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片上滴加 0.1结晶紫溶液 10 L，37 培养 24 小时，每个菌株做一个平皿。5.2.2.3.2 结果判定阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在 rfa 突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100 和 TA102 均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。5.2.2.4 R 因子（抗氨苄青霉素）的鉴定5.2.2.4.1 接种加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却到 50左右，适量倒入平皿中，平放凝固，用移液器吸 0.
33、8的氨苄青霉素 10 L，在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌株菌液与氨苄青霉素带相交叉划线接种，并且接种一个不具有 R 因子的菌株作氨苄青霉素抗性的对照，37 培养 24 小时，一个平皿可同时鉴定几个菌株。5.2.2.4.2 结果判定4 个菌株经过 24 小时培养，在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉素效应，证明它们都带有 R 因子。5.2.2.5 四环素抗性的鉴定5.2.2.5.1 接种用移液器各吸取 5L10 L 0.8的四环素溶液和 0.8的氨苄青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养基平皿表面沿中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素溶液干后，用
34、接种环取各菌株菌液与四环素和氨苄青霉素带相交叉划线接种 TA102 和一种有 R 因子的菌株（作四环素抗性的对照） ，37 培养 24 小时。5.2.2.5.2 结果判定TA102 菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明 TA102 菌株有抗四环素效应。5.2.2.6 uvrB 修复缺陷型的鉴定5.2.2.6.1 接种在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用墨纸覆盖，在距 15 W 紫外线灭菌灯 33 cm 处照射 8 秒，37 培养 24 小时。5.2.2.6.2 结果判定对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100）仅在没有照射过的一半
35、生长，具有野生型切除修复酶的菌株 TA102 仍能生长。5.2.2.7 生物素缺陷型（bio）的鉴定5.2.2.7.1 底层培养皿的制备加热融化底层培养基两瓶。一瓶加生物素，每 100 mL 底层培养基中加 0.5 mmol 分子 D-生物素 0.6 mL 和 L-组氨酸 1 mL；另一瓶不加生物素，每 100 mL 底层培养基中加 L-组氨酸1 mL，冷却至 50 左右，每种底层培养基各倒两个平皿。5.2.2.7.2 接种取有生物素和无生物素培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表面，37培养 48 小时。5.2.2.7.3 结果判定四株菌在有生物素培养基平皿表面各长
36、出一条菌膜，在无生物素培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为生物素缺陷型。5.2.2.8 自发回变率的测定5.2.2.8.1 测定方法准备底层培养基平皿 8 个。融化顶层培养基 8 管，每管 2mL，在 45水浴中保温。在每管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液 0.1mL，一式两份，轻轻摇匀，迅速将此试管内容物倒入已固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37 培养 48 小时，计数菌落数。5.2.2.8.2 结果判定每一株的自发回变率应落在附录 A A.3 所列的正常范围内。5.3 菌株的保存鉴定合格的菌株应保存在深低温（如-80 ） ，或加
37、入 9光谱级 DMSO 作为冷冻保护剂保存在液氮条件下（-196 ） 。无上述条件者可冰冻干燥制成干粉，4 保存。除液氮条件外，保存期一般不超过 2 年。主平板贮存在 4，超过二个月后应丢弃（TA102 除外，保存两周后丢弃） 。6 试验设计及受试物的处理6.1 溶剂溶剂要不与受试物发生反应，对所选菌株和 S9 没有毒性，没有诱变性。首选蒸馏水，对于不溶于水的受试物可选择其他溶剂，首选 DMSO(每皿最高添加量不超过 0.1 mL） 。也可选择其他溶剂。6.2 剂量设计决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。进行预试验有助于了解受试物对菌株的毒性和受试物的溶解度。对于
38、无细菌毒性的可溶性受试物推荐的最高剂量是 5 mg/皿或 5 L/皿；对于溶解度差的受试物，可以采用悬浊液，但溶液浑浊的程度（沉淀的多少）不能影响菌落计数。由于溶解度或者毒性的限制最大剂量达不到 5 mg/皿或 5 L/皿时，最高剂量应为出现沉淀或细菌毒性的剂量。评价含有潜在致突变杂质的受试物时，试验剂量可以高于 5 mg/皿或 5 L/皿。对于需要前处理的受试物（如液体饮料、袋泡茶、口服液和辅料含量较大的样品等） ，其剂量设计应以处理后的样片计。每种受试物在允许的最高剂量下设 4 个剂量组，包括加和不加 S9 两种情况。按等比组距的原则设定剂量间隔，推荐采用 倍组距。每个剂量应作 3 个平行
39、皿。10一般受试物的最低剂量不低于 0.2 g/皿。受试物应无菌，必要时以适当的方法灭菌或除菌。6.3 对照组的设置试验应同时设阳性对照组、溶剂对照组和未处理对照组，包括加和不加 S9 种情况。阳性对照物要根据所采用的菌株进行选择，并选择合适的剂量以保证每次试验的有效性，可参考附录 B、附录 C 或其他资料。溶剂对照组的处理方法除不加入受试物外与处理组相同。当阳性致突变物采用 DMSO 溶解，而受试物不用 DMSO 溶解时，应同时做 DMSO 溶剂对照。6.4 含组氨酸受试物 对已知和经证实含有组氨酸并可能影响试验结果的受试物必要时进行预处理（如经 XAD-树脂柱过滤） 。7 试验方法7.1
40、总则常用的实验方法有平板掺入法、预培养平板掺入法和点试法等。7.2 平板掺入法7.2.1 将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37 振荡（100 次/min）培养 10 小时或静置培养 16 小时，使活菌数不少于 1210 9/mL。7.2.2 底层培养基平皿，每个剂量加 S9 和不加 S9 均做 3 个平皿。7.2.3 融化顶层培养基分装于无菌带帽小试管（试管数与平皿数相同） ，每管 2mL，在 45水浴中保温。7.2.4 在保温的顶层培养基（试管）中依次加入测试菌株新鲜增菌液 0.1mL，混匀；实验组加受试物 0.05 mL0.2mL（一般加入 0.1mL，需活化时另加
41、10 S9 混合液 0.5mL） ，再混匀，迅速倾入铺好底层培养基的平皿上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化；37培养 48 小时观察结果，必要时延长至 72 小时观察结果。7.2.5 阳性对照组加入同体积标准诱变剂；溶剂对照组只加入同体积的溶剂；未处理对照组只在培养基上加菌液；其他方法同上。7.3 预培养平板掺入法预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定是否进行预培养。在加入顶层培养基前，先进行以下预培养步骤： a) 将受试物（需活化时另加 10 S9 混合液 0.5 mL）和菌液，在 37 中培养 20 min，或在 30 中培养 30 min；b) 再加
42、入 2 mL 顶层琼脂.其他同上述平板掺入法。7.4 点试法7.4.1 同 7.2.17.4.2 同 7.2.27.4.3 同 7.2.37.4.4 在水浴保温的顶层培养基中依次加入测试增菌液 0.1 mL（需活化时另加 10 S9 混合液 0.5 mL） ，混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿，使顶层培养基在底层分布均匀。平放固化后取无菌滤纸片（直径约为 6 mm） ，小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如 10 L） ，点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面；37 培养 48 小时观察结果。7.4.5 另作阳性对照组和溶剂对照组，分别在滤纸片上加入同
43、体积标准诱变剂、溶剂，未处理对照组滤纸片上不加物质，其他步骤同上。8 数据处理与结果评价8.1 背景菌苔观察和回变菌落计数 直接计数培养基上的回变菌落数，计算各菌株各剂量三个平皿回变菌落数的均数和标准差。8.2 掺入法结果评价 在背景生长良好的条件下，测试菌株 TA1535、TA1537、TA98 和大肠杆菌的回变菌落数等于或大于溶剂对照组的 3 倍，其它测试菌株的回变菌落数等于或大于阴性（溶剂）对照组的 2 倍，并具有以下两种情况之一的可判定为阳性结果：a) 有剂量反应关系；b) 某一测试点有可重复的、有统计学意义的阳性反应。8.3 点试法结果评价 如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌
44、落，与未处理对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物诱变试验阳性，但应该用掺入法试验来验证。8.4 验证 明显的阳性结果不需要进行验证；可疑的结果要改用其它的方法进行验证；阴性结果需要验证（即重复一次） ，应改变试验的条件，如剂量间距（改为 5 倍间距）等。8.5 对照组结果评价阳性结果表明受试物对试验菌株的基因组诱发了点突变。阴性结果表明，在该试验条件下受试物对测试菌株不诱发基因突变。9 试验报告9.1 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。9.2 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。9.3 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。9.4 试验摘要。9.
45、5 受试物：名称、鉴定资料、CAS 编号（如已知） 、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。9.6 溶剂：溶剂的选择依据，受试物在溶剂中的溶解性和稳定性。9.7 菌株：名称、浓度（细菌个数/皿）及菌株特性（包括菌株鉴定的时间和结果） 。9.8 试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。 9.9 试验结果：受试物对菌株的毒性、背景菌苔生长情况、平皿上是否有沉淀、每个平皿的回变菌落数、各剂量各菌株加和不加 S9 每皿回变菌落数的均数和标准差、是否具有剂量反应关系、统计结果、同时进行的溶剂对照和阳性对照的均数和标准差以及溶剂对照和阳性对照均数和标准差的历史范围。9.10
46、结论:本试验条件下受试物是否具有致突变作用。实验四 小鼠精子畸形试验一、实验目的1掌握传统敏感期致畸试验的原理及方法；2了解致畸实验结果观察及分析方法。二、实验原理小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及 X、Y 性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精子畸形试验可检测环境因子对精子生成、发育的影响，而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性，故本试验可用作检测环境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。三、器材与试剂（一）实验动物：实验用小白鼠（二）器材：
47、手套、注射器、镊子、灭菌干棉球、温度计、烧杯、注射器、平皿、消毒锅、玻片、生物显微镜（三）试剂：环磷酰胺,生理盐水,伊红溶液四、操作步骤1 动物处死时间：各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种致突变物后不同时间出现精子畸形，故有条件时，可给于受试物后第一、四、十周处死动物，检查精子形态。因为大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母细胞早期的生殖细胞较为敏感，故一般均是于首次给受试物后的第 35d 处死。2 用颈椎脱臼法处死小鼠，取出二侧副睾，放入盛有适量生理盐水(1mL)的小烧杯中或放入盛有 2mL 生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪 12 刀，静止 35min，轻轻摇动。用
48、四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定 5min 以上干燥。用 1%2%伊红染色 1h，用水轻冲，干燥。3 镜检：在低倍镜下(用绿色滤光片)找到背景清晰精子重叠较少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整精子。精子有头无尾(轮廓不清)或头部与其他精子或碎片重叠，或明显是人为剪碎者，均不计算，每只动物至少检查 1000 个精子。 五、结果分析与评价精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部，畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备查询。并分别记录异常类型，以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。判断双头、双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计方法比较，如用秩和检验法评价精子畸形阳性的标准是，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系。六、作业计算不同组实验组精子畸形阳性率，分析阴性对照组和阳性对照组的发生率不同的原因。
