1、专题2 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,需要为微生物提供合适的营养和环境条件,需要无菌操作,课题目标：,1.了解有关微生物种类、培养方法和培养基的基础知识。 2进行无菌技术的操作。 3进行微生物的培养。,生物技术实践： 微生物培养与利用：利用微生物进行发酵生产特定的产物。 生物学研究中的科学思想和一般方法：设计可行的实验方案和实验装置对简单的实验方案做出恰当的评价和修订,考试说明,从近年情况看，这部分知识在各区的模拟考查中多次涉及！尤其是关于灭菌方法和接种方法的选择是高频考点,（一）微生物的类群,（1）原核生物界：例如细菌、蓝藻 （2）真菌界：例如酵母菌 （3）原生生物界：例如
2、草履虫、变形虫、衣藻 （4）病毒：例如艾滋病病毒、SARS病毒,目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：,一、基础知识,（学案）生物分类填空,生物,细胞 生物,非细胞生物,病毒,真核 生物,原核 生物,细菌,动物,植物,真菌,蓝藻,微 生 物,其他,原生生物,知识梳理：细菌,大肠杆菌,淋病球菌,肉毒梭菌,霍乱弧菌,（单细胞原核生物）,1.细菌的形态,（球、 杆、 弧、 旋）,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,材料一：如果将杆菌接入浓度为0.2mol/L的蔗糖等渗溶液和盛有玻璃珠的三角瓶中加以摇动，可以使细胞壁破裂，细胞内含物流出，这样就可以得到细胞壁的空壳。空壳成杆状，而细胞内含物却
3、是圆的。 材料二：如果将细菌用溶菌酶处理，除去细胞壁，并接入到低渗溶液中，这时没有细胞壁的细胞膜就会破裂，原因是细胞过度吸水膨胀使细胞膜胀裂。用纤维素酶和果胶酶处理则无此现象。,（1）细菌的细胞壁,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,由材料分析细胞壁的功能？,细菌细胞壁的主要功能：保护和维持细胞形状,细菌细胞壁的主要成分：肽聚糖,（1）细菌的细胞壁,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,（2）细胞膜,成分：脂质和蛋白质 功能特性：选择性透过性 膜上含有呼吸作用等能量代谢的酶系统，是细胞的产能场所，如可发生有氧呼吸。,(3)拟核(无成形的细胞核),含有一个DNA分子，DNA分子不缠绕组蛋白，不形成染色体,
4、2.细菌的结构,知识梳理：细菌,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,（4）细胞质,核糖体：蛋白质合成场所 质粒：小型环型DNA，含有抗药性基因、固氮基因、抗生素生成基因,贮藏性颗粒：淀粉粒、 硫粒,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,（5）荚膜,作用： 防止细菌丢失水分； 防止被真核生物吞噬； 防止噬菌体的侵袭。成分：主要为水分、 多糖、多肽,2.细菌的结构,知识梳理：细菌,某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢(内生孢子）。能够使细菌度过不良的环境。每一个细菌形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。,（6）芽孢,知识梳理：细菌,2.细菌的结构
5、,（6）芽孢,知识梳理：细菌,2.细菌的结构,（7）鞭毛,参与某些细菌运动,荚膜、芽孢等不是细胞生活的必要结构，但它对细菌在环境中的生存有利。,知识梳理：细菌,3、细菌的繁殖：,细菌的主要繁殖方式： 分裂生殖（二分裂）,分裂中的链球菌,分裂中的大肠杆菌,过程包括： 1、细胞增大、伸长 2、DNA分子复制 3、细胞中部的细胞膜和细胞壁向内生长形成隔膜，细胞质一分为二，形成二个子细胞,4.菌落（高三考查较多）,（1）定义：是单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见具有一定形态结构的子细胞群体。,举例：有荚膜细菌：菌落光滑。S型无荚膜细菌：菌落粗糙。R型,（2）特征：表现在菌落的大小、形状
6、、光泽度、颜色、硬度透明度等方面。,（3）功能：菌落特征是鉴别菌种的重要依据,知识梳理：细菌,如何培养细胞微生物（大肠杆菌）？如何培养病毒（噬菌体）？,思考：,用特定的培养基,用特定的活宿主细胞,标记35S的噬菌体,用含35S培养基培养细菌,用35S物质配制培养基,用噬菌体侵染含35S的细菌,32P,32P,32P,32P,细胞微生物要利用培养基可以培养，但由于病毒（非细胞微生物）是营专性寄生生活的生物，只能利用活细胞培养。 由于病毒对寄主的选择有专一性，因此在培养不同的病毒时，所利用的活细胞类型要不同。 植物病毒要用植物细胞培养，噬菌体就要用细菌培养，而流感病毒（动物病毒）一般都用鸡胚细胞培
7、养。,(二)微生物培养基,1.培养基概念： 人工配制的用于培养微生物（或动物、植物的细胞、组织）的营养物质。,2.培养基的成分： 微生物的元素组成：C、H、O、N、P、S 营养来源：自然界中的无机物、有机物 微生物生长需要的物质营养要素(碳源、氮源、无机盐、水),(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（1）碳源,概念：能为微生物提供所需碳元素的营养物质，需要量最大。 种类：无机碳源 CO2、NaHCO3有机碳源(有机物) 糖类、脂肪酸等有机物；(天然成分混合物)花生粉饼石油等 常用的碳源：糖类（尤其是葡萄糖）,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（1）碳源,功能：构成微生物的细胞质和一些
8、代谢产物；异养微生物主要能源物质,思考：,糖类（葡萄糖）；花生粉饼等,1.大肠杆菌，硝化细菌，蓝细菌，乳酸菌分别选用哪种碳源？,2.实验室培养微生物和工业生产微生物代谢产物时，分别选用哪种碳源？,糖类，二氧化碳，二氧化碳，糖类,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,（2）氮源,概念：能为微生物提供所需氮元素的营养物质 种类：无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素； 有机氮源：牛肉膏、蛋白胨,常用的氮源：铵盐、硝酸盐 自养型生物-绿色植物(铵盐、硝酸盐) 异养型生物-动物、大量异养微生物（“含C、H、O、N”的有机物常是异养微生物的能源、碳源兼氮源）,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：
9、,（2）氮源,功能：合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,培养根瘤菌、大肠杆菌、硝化细菌时分别需要哪一类氮源？,思考：,N2，铵盐或硝酸盐，NH3,(二)微生物培养基,2.培养基的成分：,注意：关于能源物质 自养型：光能自养：太阳光化能自养：无机物（氧化放能） 【例】硝化细菌 氨的氧化 异养型：有机物（氧化分解放能）,（3）水 （4）无机盐,思考 若乳酸菌、根瘤菌、固氮蓝藻、硝化细菌混合在一起，我们配制什么样的培养基可以将三种微生物分离？,光能,糖类等含碳有机物,N2,有机物,CO2,铵盐、硝酸盐、有机氮,糖类等含碳有机物,有机物,氨,氨,CO2,N2,(二)微生物培养基,3.满足微生物生长的条
10、件：,培养基除要提供上述几种主要营养物质外，还满足微生物生长的 pH 、 特殊营养物质 和氧气 等要求。,pH：真菌 5.06.0 细菌 6.57.5放线菌 7.58.5,(二)微生物培养基,3.满足微生物生长的条件：,特殊营养物质 概念：微生物生长不可缺少的微量有机物 添加原因：微生物自身缺乏合成这些物质的酶或合成能力有限 种类：各种维生素、氨基酸、碱基等 功能：酶、核酸的组成成分 例如：培养乳酸菌时需要添加维生素 但不是所有的微生物培养时都需要外源添加。,生长因子,(二)微生物培养基,4.培养基的配制原则：,（1）目的明确选材料（代谢特征、用途）,（2）营养协调 （注意营养物质的浓度和比例
11、）,（3）pH适宜,(二)微生物培养基,（1）按物理性质划分：,5.培养基的种类：,（固体、半固体培养基需添加凝固剂，如琼脂；两者的差别是添加量的多、少）,（用于工业生产）,（用于观察微生物的运动、鉴定菌种）,（用于微生物的分离、计数）,微生物在其表面生长可形成菌落,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（2）按化学成分划分：合成培养基天然培养基,用化学成分已知的化合物 配制,含化学成分不明的天然物 质，如酵母膏,前者常用于实验室中对微生物的分类、鉴别； 后者常用于大规模工业生产。,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,加入某化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要微生物的生长。,
12、加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴定不同种类的微生物。特定菌种显色，其他菌种不受抑制、但不显色。,（3）按用途划分：,（作用：分离微生物、进行选择培养）,（作用：鉴别微生物）,青霉素,选择培养基,在基因工程中，对导入重组质粒的大肠杆菌的筛选,伊红美蓝,鉴别培养基,A,A,B,B,C,C,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上菌落呈现黑色,常见的选择培养基举例： （1）添加：青霉素 ：抑制细菌、放线菌保留（分离）真菌，如霉菌、酵母菌高浓度NaCl：抑制多种细菌，分离金黄色葡萄球菌,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（3）按用途划分：,常见的选择培养基举例： （2）缺少：培养基缺少有机碳源分离自
13、养型微生物（利用CO2 ）培养基缺少氮源分离固氮微生物（利用N2 ）,(二)微生物培养基,5.培养基的种类：,（3）按用途划分：,（三）无菌技术,1.获得纯净培养物的关键(目的）是 防止外来杂菌的入侵 。,（三）无菌技术,2.无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。,思考 无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有什么目的？,有效避免操作者自身被微生物感染,思考： 消毒和灭菌的区别？哪一个
14、更彻底？ 什么时候需要消毒，什么时候需要灭菌？,消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物营养体（不包括芽孢和孢子）。 灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,灭菌效果更彻底，用于各种金属、 玻璃器具。,消毒用于各种实验操作空间、操作者的衣着和手。,（三）无菌技术,2.无菌技术包括：,（三）无菌技术,3.消毒方法：,（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法； （2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法，如牛奶。 （3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。 （4）
15、实验操作者的双手使用70%酒精 进行消毒。 （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（1）灼烧灭菌法：用于金属用具（接种环、接种针）、试管口和瓶口的灭菌；,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（2）干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属用具的灭菌 ，所用设备是 干热灭菌箱 ；,160170 ， 12小时,（三）无菌技术,4.灭菌方法：,（3）高压蒸汽灭菌法：用于培养基、无菌水、玻璃器皿等的灭菌 ，所用设备是 高压蒸汽灭菌锅 。,高压灭菌锅,121，100kPa， 15-30分钟,【补充】,消毒和灭菌的比较（见5+3P.263表）,二、实验操作 （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,
16、1.计算：,2.称量：,3.溶化： 加水定容，调pH,4.灭菌：,5.倒平板：（或搁置斜面）,包好再高压蒸汽灭菌（121，100kPa，15-30分钟）。斜面培养基需先分装，加棉塞，再包好、灭菌。,培养基冷却到50 ，酒精灯火焰旁操作。,称量,调pH,培养基分装,1/5,加棉塞,2/3,包扎,灭菌,搁置斜面,斜面不超过试管总长的1/2,倒平板,夹,倒,灼,倒,思考：,（1）培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。可用_ _的办法估计培养基的温度。 （2）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 灼烧灭菌，防止瓶口被微生物污染。,感觉盛有培养基的锥形瓶不烫手,(3)平板冷凝后，为什么要将平
17、板倒置？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,思考：,思考：,(4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,不能；空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。,【提醒关于斜面培养的问题】 配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。 试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。,（二）纯化大肠杆菌：,1.纯化培养技术：,自然环境中，微生物混在一起生长，要想纯培养，首先要将单个细胞与其他细胞分离
18、开，进而培养成可见的群体（即菌落）。,2.常见接种方法：（高频考点）,平板划线法：主要用于纯化培养 稀释涂布平板法：主要用于分离菌种并计数,（二）纯化大肠杆菌：,其他接种方法：斜面接种、穿刺接种 这些技术的操作方法各不相同，但其核心都是：_,防止杂菌污染，保证培养物的纯度,（二）纯化大肠杆菌：,2.常见接种方法：,(1)平板划线法：,通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可分离到由一个细胞繁殖而来的菌落。 此法主要用于纯化培养,接种环,模拟平板划线：,1,2,3,4,5,平板划线,（二）纯化大肠杆菌：,2.常见接种方法：,(1)平板划
19、线法：,接种过程中哪些步骤保证了无菌操作？ 对接种环、瓶(皿)口及时进行灼烧灭菌； 迅速进行操作； 将划线后的平板倒置。,思考,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,第一步灼烧：消灭接种环上的微生物避免污染培养物； 每次划线前灼烧：为了杀死上一次划线结束后，接种环残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 操作结束后灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境及感染操作者。,思考,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,避免
20、接种环温度太高，杀死菌种,在作第二次及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（二）纯化大肠杆菌：,2.常见接种方法：,(2)稀释涂布平板法：,将菌液进行一系列的梯度稀释后，分别涂布到固体培养基表面。稀释度足够高时，能培养出单个菌落。 主要用于分离菌种并计数。,涂布器,系列稀释,10-1,10-2,涂布平板,滴,灼,试,涂,思考：,对涂布器、瓶(皿)口及时进行灼烧灭菌； 吸管头不要接触任何物体； 在火焰周围迅速操作。,接种过程
21、中如何进行无菌操作？,三、结果分析与评价,思考： 若将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放在37 恒温箱中，培养一天，观察到如下结果，请分析可能的原因。,1.在培养时，培养皿是否需要倒置？,需要,三、结果分析与评价,未接种培养基的作用是对照，应该没有菌落生长，若有菌落，说明培养基灭菌不彻底或被污染。,2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？,三、结果分析与评价,3在培养基上观察到了不同形态的菌落，可能的原因是？,不同的菌落代表不同的微生物；产生原因可能是培养基或接种过程中有其它微生物污染。,4. 培养12h和24h后观察到的实验结果相同吗？,菌落大小：变大；菌落分布位置：不变。,四、课题延伸： 1菌种的临时保存： 将菌种接种到试管的固体斜面培养基，放入4冰箱中保存。以后每36个月，要将 菌种转移到新的培养基。,四、课题延伸：,2菌种的长期保存：3ml甘油瓶中装入1ml甘油后灭菌，再加入1ml菌液，混匀后放入-20冷冻箱保存。,微生物的实验室培养,总结,
