1、DNA 甲基化 PCR 引物的设计2010-08-03 12:01DNA 甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA 甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子 CpG 岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生1。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究 DNA 甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有 1 个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测 CpG 岛,根据实验者要求设计硫化测序 PCR(bisulfa
2、te-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物。本研究旨在介绍甲基化特异性 PCR引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的使用方法和有关注意事项。 1 材料与方法1. 1 序列的转换DNA 经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA 双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的 DNA 的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的 DNA 模板设计引物时,先输入感兴趣的 DNA 序列,程序将会显示 2 种序列:一种是输入的源 DNA 序列;另一种是硫
3、化处理后的 DNA 序列,除了 CpG 岛上的 5 甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行 BSP 和 MSP。1. 2 CpG 岛的预测2哺乳类动物基因组中 5% 10%是 CpG(二核苷酸),其中 70% 80%呈甲基化状态,称为甲基化的 CpG(mCpG)。CpG 的聚集称 CpG 岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的 5端调控区均有 CpG 岛呈高度甲基化,基因组中平均 100 个 bp有 1 个跨度为 0. 55 kb 的 CpG 岛。“MethPrimer”设计程序默认的 CpG 岛跨度至少为 200 bp,GC 含量5
4、0%,CpG 出现频率0. 6。因此,符合这些参数的区域都默认为 CpG 岛,我们根据任意 1 个 CpG 岛设计引物进行扩增。1. 3 BSP 的引物设计原则标准的 PCR 引物设计原则同样适用于硫化测序 PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准 PCR 的一些参数外,“MethPrimer”应用 3端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC 含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的 Tm 区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为 8
5、个,而其他碱基重复数为 5 个。DNA 的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化 CpG 的“C”区域作为源序列,设计引物。对于 BSP,引物设计的原则1:为了区别甲基化DNA 和非甲基化 DNA,引物不应含有 CpG 位点;引物扩增的产物应包含尽可能多的 CpG 位点。1. 4 MSP 的引物设计原则3,4对于 MSP 需要设计 2 对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的 DNA。根据甲基化的 DNA 为模板的 PCR 扩增甲基化的 DNA;根据非甲基化的 DNA 为模板的 PCR 扩增非甲基化的 DNA。MSP 引物设计
6、的原则:为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3端至少包含 1 个 CpG 位点,我们可以自己设定 CpG 的“C”距 3末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为 3,即是在引物的最后 3 个碱基中,至少有 1 个是 CpG 的“C”。引物序列中应包含尽可能多的 CpG 位点。甲基化引物和非甲基化引物序列 3端应处于相同的 CpG 位点。如果,2 对引物不在相同的 CpG位点退火, PCR 结果就不能准确反映样本 DNA 甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受 Tm 值限制,由于非甲基化引物
7、中的“C”转化成“T”,导致 GC 含量降低,从而引起 Tm 降低。2 套引物应有相近的 Tm 值,“MethPrimer”中默认 2 套引物 Tm 值相差不超过 5,这种限制可使 2 个 PCR 反应在同一 PCR 仪中进行。2 结果2. 1 MethPrimer 设计的 BSP 引物我们运用人雌激素受体 (ER)启动子序列(AF191544)来设计硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)引物。首先进入免费在线引物设计程序“MethPrimer”(http: /www. uro-gene. org/methprimer/),点击“Go to MethPri
8、mer”,进入“MethPrimer-Design Primers forMethylation PCRs”网页(http: /www. urogene. org/methprimer/index1. html),在网页的方框内输入 ER 启动子序列,选择“Pick primers forbisulfite sequencingPCR or restriction PCR”,其他参数选择程序默认值,也可根据实验需要加以限制,然后点击“Submit”键,“MethPrimer”软件即可显示预测的 ER 启动子序列的CpG 岛及引物的相应位置,同时也显示设计的 BSP 引物有 5 组,我们可选择
9、1 组引物进行 PCR(表 1),通常情况下选择第 1 组引物,进行 PCR。如果所选择的引物PCR 效果不佳,可选择其他几组引物,也可优化 PCR 反应条件,或者是更改 BSP 引物设计参数,重新设计引物。表 1 M ethPrim er 软件设计的 ER 启动子的 BSP 引物引物 起始 大小 Tm() GC 含量 引物序列(53)(bp) (bp) (% )1 上游引物 1 163 25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物 1 370 25 58.26 64.00 ACCCTCAAAAAATCACTAAAAAAAC2 上游引物 1 163
10、25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物 1 377 25 59.47 56.00 ATTCTCAACCCTCAAAAAATCACTA3 上游引物 1 163 25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物 1 365 25 56.92 56.00 CAAAAAATCACTAAAAAAACCTTTC4 上游引物 1 152 25 59.06 60.00 GGGTGAGGGGAATATTTTATTAAGT下游引物 1 377 25 59.47 56.00 ATTCTCAACCCTCAAAAAATCACTA5
11、 上游引物 1 161 26 58.32 53.85 GAATATTTTATTAAGTTGGGGGAATT下游引物 1 370 25 58.26 64.00 ACCCTCAAAAAATCACTAAAAAAAC2. 2 MethPrimer 设计的 MSP 引物输入 ER 启动子序列,选择“PickMSP primers”,其他参数选择程序默认值,点击“Submit”,“MethPrimer”软件即可显示预测的 ER 启动子序列的CpG 岛,及引物的相应位置,同时也显示设计的 MSP 引物,有 5 组引物,每组分别有甲基化引物、非甲基化引物,我们可选择 1 组引物进行 PCR(表 2),通常情况
12、下选择第 1 组引物,进行 PCR,如果所选择的引物 PCR 效果不佳,可选择其他几组引物,也可优化 PCR 反应条件,或者是更改 MSP 引物设计参数,重新设计引物。表 2 M ethPrim er 软件设计的 ER 启动子的 M SP 引物引物 起始 大小 Tm() GC 含量 引物序列(53)(bp) (bp) (% )1 上游甲基化引物 1 406 25 58.99 64.00 TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571 23 59.46 65.22 ACCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物 1 409 24 55.40 66.6
13、7 TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物 1 572 24 59.01 62.50 AACCAATCTAAAAACCACACTTCA2 上游甲基化引物 1 406 25 58.99 64.00 TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 570 22 58.67 63.64 CCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物 1 409 24 55.40 66.67 TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物 1 572 24 59.01 62.50 AACCAATCTAAAAACCACACTTCA3 上游甲
14、基化引物 1 406 25 58.99 64.00 TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 569 23 58.36 60.87 CAATCTAAAAACCACACTTCGAA上游非甲基化引物 1 409 24 55.40 66.67 TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物 1 572 24 59.01 62.50 AACCAATCTAAAAACCACACTTCA4 上游甲基化引物 1 406 25 58.99 64.00 TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571 23 59.46 65.22 ACCA
15、ATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物 1 408 25 56.22 68.00 GTTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物 1 572 24 59.01 62.50 AACCAATCTAAAAACCACACTTCA5 上游甲基化引物 1 406 25 58.99 64.00 TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571 23 59.46 65.22 ACCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物 1 407 26 58.51 65.38 TGTTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物
16、 1 572 24 59.01 62.50 AACCAATCTAAAAACCACACTTCA3 讨论引物的成功设计对于 PCR 是至关重要的,硫化反应促使 DNA 链中的“C”转化为“U”,导致 GC 含量降低,使 PCR 反应后在序列中出现长的连续“T”,容易引起 DNA 链的断裂5, 6。此外,纯化过程中的 DNA 的丢失,也是要考虑的另一个因素,这些因素又会影响下面的 PCR 的进行,这些都是设计 PCR 引物时需要考虑的。一般情况下, PCR 产物的长度大于 300 bp 时,就很难以硫化 DNA 为模板进行扩增。因此,“MethPrimer”程序设计 PCR 产物的长度在 10030
17、0 bp, 200 bp的长度比较合适。与标准 PCR 不同的是甲基化 PCR 引物的长度,甲基化 PCR 一般需要更长的引物,引物长度在 30 bp 左右,原因是硫化降低了模板 DNA 的 GC 含量,使序列中出现长的连续“T”,导致很难选择具有合适的 Tm 值及稳定的引物;另一方面,为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的 DNA,需要引物有足够数量的“C”,这些都增加了选择稳定引物的困难。因此,为了获得更稳定的双链,选择更长的引物是有必要的,因为 DNA 的 Tm 值取决于引物的长度7。一般情况下,甲基化 PCR 引物的长度在 2030 bp。“MethPrimer”默认的引物长度
18、在2030 bp, 25 bp 为最适长度。“MethPrimer”在设计引物时,不考虑输入序列中的重复元件和载体序列。因为,对于 DNA 甲基化的研究,我们一般注重有特点的序列或者序列中确定的区域,大部分这些序列或区域是启动子序列,因此载体序列不考虑;另一方面,输入的序列由程序模拟硫化处理发生了转化,这样重复的元件不再重复了,即使是引物位置所在的序列在转化前是重复序列,也不会影响引物的质量。总之,“MethPrimer”是一个特异性的针对硫化 PCRs(BSP 和 MSP)设计引物的程序,其操作简便、快速、准确,对于研究 DNA 甲基化是一个至关重要的工具。目前,“MethPrimer”正在
19、进一步地发展和完善,使它可以设计出更多其他的硫化 PCRs 的引物。关键词:甲基化; PCR中图法分类号:R394-33 文献标识码:B参考文献:1 PaulsenM, Ferguson-SmithA C. DNAmethylation in genomic imprinting, development, and diseaseJ. JPatho,l 2001, 195(1): 97-110.2 Ribeiro-Filho LA, Franks J, SasakiM,et al. CpG hypermethylation ofpromoter region and inactivation
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