1、抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法*王丽梅1罗 义1， 2毛大庆3周启星1(1南开大学环境科学与工程学院教育部环境污染控制过程与基准重点实验室 ， 天津 300071;2天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室 ， 天津 300071;3沈阳药科大学生命科学与生物制药学院 ， 沈阳 110016)摘 要 抗生素在医药 、畜牧和水产养殖业的大量使用造成了环境中抗性耐药菌和抗性基因日益增加 ， 抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物引起人们的广泛关注 . 本文综述了近年来国内外有关抗生素抗性基因的研究进展 ， 其在水 、土壤 、空气等环境介质中和动 ， 植物体内的传播扩散 ， 以及开展
2、环境中抗生素抗性基因研究的必要性 ， 重点介绍了有关抗生素抗性 ( 包括抗性细菌和抗性基因 ) 的研究方法 ， 指出抗性基因研究中存在的问题 ， 并对未来的相关研究进行了展望 .关键词 抗生素 抗生素抗性 抗性耐药菌 抗生素抗性基因文章编号 1001 9332( 2010) 04 1063 07 中图分类号 X171 文献标识码 ATransport of antibiotic resistance genes in environment and detection methods of antibioticresistance. WANG Li-mei1， LUO Yi1， 2， MAO
3、Da-qing3， ZHOU Qi-xing1(1Ministry of EducationKey Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria， College of Environmental Scienceand Engineering， Nankai University， Tianjin 300071， China;2Tianjin Key Laboratory of Remedia-tion and Pollution Control for Urban Ecological Environment， Ti
4、anjin 300071， China;3College ofLife Science and Biopharmaceutical， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， Chi-na) . -Chin. J. Appl. Ecol. ， 2010， 21( 4): 1063 1069.Abstract: The large scale use of antibiotics in medicine， animal husbandry， and aquaculture in-duces the increasing emerge
5、nce of antibiotic resistance bacteria and antibiotic resistance genes( ARGs)， and， as a kind of new environmental contaminants， the ARGs are attracted much atten-tion by the public. This paper summarized the research progress of ARGs in recent years， and dis-cussed the transport of ARGs in water， so
6、il， and air， and in plants and animals. The necessity ofthe study on ARGs in environment and the existing problems in present studies were pointed out，and the research methods of antibiotic resistance ( including antibiotic resistance bacteria andARGs) were introduced. Some related research directio
7、ns were proposed.Key words: antibiotics; antibiotic resistance; antibiotic resistance bacteria; antibiotic resistancegene.* 国家自然科学基金项目 ( 20777041， 30870363) 和天津市自然科学基金项目 ( 08JCYBJC02700) 资助 .通讯作者 . E-mail: luoy nankai. edu. cn2009-10-09 收稿 ， 2010-01-19 接受 .长期以来 ， 抗生素在保障人类健康和促进畜牧业发展方面发挥了重要作用 ， 由于能预防疾
8、病和促进生长 ， 目前经常作为亚治疗剂量添加在动物饲料中 1. 但近年来 ， 抗生素的过度使用开始引起人们的广泛关注 ， 主要集中于日益出现的抗生素耐药菌和抗性基因 . 世界卫生组织 ( WHO) 已将抗生素抗性基因 ( ARGs) 作为 21 世纪威胁人类健康的最重大挑战之一 ， 并宣布将在全球范围内对控制 ARGs 进行战略部署 . 自 Pruden 等 2将抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物提出之后 ， 有关其在环境中传播和污染等的报道日益增多 .本文综述了近些年来国内外对环境介质中抗生素抗性基因的研究现状 ， 指出研究的必要性 ; 重点介绍了有关抗生素抗性 ( 包括抗性细菌和抗性基因
9、 )的研究方法 ， 指出抗性基因研究中存在的问题 ， 最后对未来的研究方向进行了展望 .应 用 生 态 学 报 2010 年 4 月 第 21 卷 第 4 期Chinese Journal of Applied Ecology， Apr.2010， 21( 4): 1063 10691 抗生素抗性基因在环境中的传播扩散1. 1 抗生素抗性基因在水环境中的传播扩散目前 ， 抗生素主要用于人类医疗业和动物畜牧养殖业 ， 随着后者向集约化发展 ， 对兽用抗生素的使用和消耗已经超过人用 . 据报道 ， 美国 2000 年共消耗 16200 t 抗生素 ， 其中 ， 70%用于兽药 ， 30%用于人类医
10、药 3. 抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用 ， 已在养殖动物肠道内诱导出携带抗性基因的菌株 ， 这些抗性菌株是环境中抗生素抗性基因的重要来源 .许多研究表明 ， 养殖场化粪池系统内的抗性菌及抗生素抗性基因能够通过渗透 、泄漏等途径进入地下水和地表水等水环境 4 5. Chee-Sanford 等 4在养猪场附近的化粪池内监测到 8 种编码核糖体保护蛋白的四环素抗性基因 ， 即 tet( O) 、tet( Q) 、tet( W) 、tet( M) 、tetB( P) 、tet( S) 、tet( T) 和 otrA. 这些抗性基因可渗滤到地下水中 ， 在化粪池下游 250 m 处的地下水中仍能
11、检测到 . Koike 等 5在此研究的基础上 ，于 20002003 年连续对化粪池及地下水中的四环素抗性基因进行监测 ， 结果显示 ， 所有采样点均含有RPP 基因 tet( M) 、tet( O) 、tet( Q) 、tet( W) 和外排泵基因 tet( C) 、tet( H) 、tet( Z) . Peak 等 6对美国中西部 8 个化粪池 ( 分属于 5 个养牛场 ) 内的 6 种四环素抗性基因进行了连续 6 个月的在线监测 ， 结果表明 ，抗生素抗性基因的丰富度与抗生素的使用量有关 ，大量使用与混合使用抗生素的抗性基因含量显著高于不使用抗生素 ， 而大量四环素抗性基因会对水质产生
12、影响 . 由此可见 ， 化粪池是抗生素抗性基因向水环境转移的重要储存库 .水产养殖是抗生素抗性基因进入水环境最直接的途径 . 水产养殖区的鱼体内 、水体和底泥中均监测到抗生素抗性基因 ， 表明抗生素在水产养殖业的大量使用可能使水产养殖区成为抗生素抗性基因的暂时存储库 7 8. 抗生素不仅可直接投加到水体中 ， 还可通过作为饲料的动物粪便 ( 残留抗生素及抗性基因 ) 间接进入水体 9. 从 35 条人工养殖的淡水鱼罗非鱼 ( Telapia mossambica) 溃疡皮肤细胞中分离出21 个嗜水气单胞菌 ， 测定其对 10 种抗生素的敏感性 ， 结果表明 ， 所有细菌均对氨比西林具有抗性 ，
13、 大部分对链霉素 、四环素及红霉素具有抗性 10. 这些抗性基因很可能通过食物链进行垂直传递 ， 最终进入动物或人的肠道中 ， 也可能通过基因水平转移扩散到其他微生物体内 .污水处理系统是抗性基因进入水环境的重要途径 . 抗生素抗性基因随医疗废水 、制药业废水和动物养殖场污水等进入污水处理系统后 ， 由于现有的水处理技术对许多抗生素类物质没有明显的去除效果 11 13， 污水出水中仍有相当浓度的抗性基因存在 14 15. 大量研究均表明 ， 污水处理厂的进水 、出水及底泥中均含有相当浓度的耐药抗性菌株或抗生素抗性基因 . 而且生物处理和紫外消耗都无法有效去除高水平的四环素抗性基因 15. 由此
14、可见 ， 污水处理系统是抗生素抗性基因的重要储存库 .由于污水经污水处理厂处理后直接排入河流或用于农业灌溉 ， 故河流中耐药菌和抗性基因报道日益增多 16 18. Pei 等 17采用定量 PCR 法对 Cache LaPoudre 河 5 个采样点 ( 分别为无污染区 、轻度农业活动污染区 、城市污水排放区 、农业活动严重污染区 、城市和农业混合污染区 ) 的抗生素抗性表型及抗性基因进行了研究 ， 结果表明 ， 受人类干扰区域的四环素类及磺胺类抗性基因水平明显高于未受干扰区域 . 胡建英等 18对北京温榆河流域的耐药大肠杆菌表现型和基因型进行了研究 ， 表明大肠杆菌对 9种抗生素中的一种或多
15、种产生抗性 ， 其中对磺胺类 、四环素及氨比西林的抗性最为明显 ; 经抗性基因检测发现 ， tet( M) 基因首次出现在河流中 ， 表明抗性基因可以通过水平基因转移在微生物间传播 .目前 ， 海滩娱乐水域的抗生素抗性问题越来越受到人们的关注 、研究表明 ， 海滩娱乐水域可能成为携带抗生素抗性基因的微生物传播扩散的又一媒介 19 21.1. 2 抗生素抗性基因在土壤环境中的传播扩散目前有关抗生素抗性基因在土壤环境中迁移转化规律的研究还不系统 ， 但已有研究表明 ， 它不仅能在动物肠道的菌株间传播 ， 还可以通过粪便施肥传播给土壤土著细菌 . Jensen 等 22研究了动物粪肥使用前后土壤中假
16、单胞菌 ( Pseudomonas spp. ， 革兰氏阴性菌 ) 和蜡状芽孢杆菌 ( Bacillus cereus， 革兰氏阳性菌 ) 抗性水平的变化 ， 结果表明 ， 动物粪肥对土壤中的抗性细菌具有选择压力 ， 施肥是耐药微生物及抗性基因进入土壤环境的主要途径 . 有关动物粪便施肥诱导土壤环境产生抗生素抗性基因的研究多见报道 23 24. 相比之下 ， 关于动物养殖业的抗生素残留对土壤环境中抗性基因的选择性压力有较少研究 . Sengelv 等 23对施用了猪粪水的农田的可培养土壤细菌进行了为期 8 个月的针对四环素 、大环内酯类和链霉素的抗性筛选研究 ， 结果显示 ， 农田中抗4601
17、 应 用 生 态 学 报 21 卷性细菌数量明显增加 ， 耐四环素细菌增加尤为显著 .Schimitt 等 25采用微宇宙及现场调查的方法研究了猪粪对土壤中四环素及磺胺类抗性基因多样性的影响 ， 结果显示 ， 施肥后土壤中抗性基因数量明显增加 ， 但直接加入氧四环素对抗性基因多样性的影响很小 ， 这表明动物施肥是影响抗性基因丰度的重要因素 . 在养猪场附近的典型土壤土著菌中发现四环素抗性基因 tet( M)， 表明其可通过肠道菌株向土壤微生物传播 5.1. 3 抗生素抗性基因在空气中的传播扩散目前在大气环境中发现抗生素抗性 ， 相关研究主要集中在养殖场附近的空气环境中分离到耐药细菌及抗性基因的
18、报道 . Gibbs 等 26揭示了大规模养猪场内及其下风处的空气中多种细菌 ( 包括金黄色葡萄球菌 、沙门氏菌 、粪大肠菌群及总大肠菌群 ) 对多种抗生素产生抗性 . Chapin 等 27发现 ， 集中式养猪场内的空气中大约 98% 的革兰氏阳性菌对至少两种养猪场常用抗生素 ( 包括大环内酯类 、林克胺类 、四环素 ) 产生抗性 . Sapkota 等 28在此研究基础上 ， 采用 DNA 分子杂交和 PCR 法 ， 研究发现 ， 所有受试菌 ( 包括肠球菌链球菌 ) 均含有多重对大环内脂类 、林可胺类 、红霉素及四环素 ( 含称 MLS) 的抗性基因 ， 50%的肠球菌和 44% 的链状
19、球菌含有多重四环素抗性基因 . 以上研究表明 ， 吸入养猪场内的空气可能是耐多重药物细菌性病原体向人体传播的一个暴露途径 ， 养猪场空气中的革兰氏阳性菌可能是抗性基因的储存库 .1. 4 动植物体内抗生素抗性基因的研究食物链是抗生素抗性基因进入人体最直接的途径 ， 因此 ， 在食品领域开展相关研究显得非常必要 .对从美国爱荷华州 ( Iowa) 981 个零售生肉样品 ( 包括鸡肉 、火鸡肉 、猪肉 、牛肉 ) 中分离出的肠球菌进行药敏试验发现 ， 生肉中存在多种抗生素 ， 如奎奴 -达福普丁和庆大霉素的耐药菌株 29. Johnston 等 30从美国西南部收获的新鲜芹菜 、香菜 、菠菜等蔬
20、菜中分离出了肠球菌属 ， 并采用药敏试验鉴定其抗性类型 ， 结果表明 ， 新鲜果蔬中含有大量常用抗生素 ( 如环丙沙星 、四环素 、呋喃妥英等 ) 的耐药肠球菌 .即使在远离抗生素暴露的环境也有检出抗生素抗性的报道 . Gilliver 等 31在英国西北部尔半岛的啮齿类动物野鼠沙田鼠 ( Clethrionomys glareolus) 和小林姬鼠 ( Apodemus sylvaticus) 的粪便中发现了阿莫西林 -克拉维酸 、头孢呋辛 、甲氧苄氨嘧啶及四环素的耐药大肠菌 ， 但这些动物基本上没有抗生素暴露史 . 之后又有报道称 ， 在最偏远 、最隔离的玻利维亚群落也发现了抗药性菌株 ，
21、 这表明即使在无抗生素直接暴露的情况下 ， 抗性细菌也可经其他途径进行传播 ， 鸟类可能是其重要的传播载体 32. 在北极的鸟类体内分离出了携带抗菌素抗性物质决定子的大肠杆菌 33， 再次表明在无抗性压力条件下仍可诱导出抗性基因 . 以上研究表明抗生素抗性具有在世界范围内传播扩散的潜在风险 .2 开展环境中抗生素抗性基因研究的必要性目前 ， 全球医疗业的抗生素滥用情况十分严重 .1990 年欧盟各国已开始对环境中抗生素进行风险评估研究 ， 并对人用和兽用抗生素做出了严格的限定和制定了相应的法规 ， 但世界范围内 ， 仍有越来越多的抗生素因被授权用于医疗业而投入生产和使用 . 例如 ， 德国目前
22、已有 5 万种抗生素药品被注册用于人类医疗 ， 其中 2700 种被大量使用 ， 而这其中又包含 900 种不同的药物活性物质 . 英国大约已授权3000 种药物活性物质的生产 34. 我国由于医药管理方面的原因 ， 乡村和城市中对低端和高档抗生素的滥用同时存在 ， 使得抗生素滥用情况更为复杂 、严重 35.随着畜牧养殖集约化发展 ， 其抗生素滥用情况更为严重 ， 直接后果很可能是诱导动物体产生抗性耐药菌 ， 并在环境中传播扩散 . 已有研究表明 ， 畜牧活动可导致动物体内的抗性菌株扩散到环境中 ， 并通过质粒交换等水平基因转移方式将抗性基因传播给环境微生物 4， 36， 这些微生物又可能通过
23、多种方式传播进入人体 ， 最终对人类健康和生态安全相成巨大威胁 . 人工养殖的鱼 、虾 、贝体内的抗性菌株和抗性基因经排泄后 ， 可对养殖区域 、周围农业环境和人居环境造成基因污染隐患 ; 对公共健康和食品 、饮用水安全构成威胁 . 因此 ， 针对以上现状开展相关研究 ， 揭示抗生素抗性基因在渔业和畜牧环境中的扩散和传播规律 ， 对于评价抗生素抗性基因的生态风险十分必要 ， 并且任务紧迫 ， 这还将在很大程度上促进畜牧和养殖业的可持续健康发展 . 对新型环境污染物抗性基因的研究将引起公众和政府权利机构对基因污染的重视 ， 进而制定相应政策并加强监管力度 ， 最终有助于评估 、减轻或控制基因污染
24、对生态环境和人体健康造成的危害 ， 并推动公共卫生事业健康发展 .3 抗生素抗性的研究方法由于微生物是抗生素抗性基因最重要的宿主 ，56014 期 王丽梅等 : 抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法因此 ， 对抗生素抗性的研究应包括耐药微生物和其携带的抗性基因两部分 ， 对前者的研究是此项研究的必备基础 .3. 1 基于细菌培养的研究方法抗生素抗性的传统研究方法主要是基于微生物培养 ， 通过抗性表型来评价其抗性 ; 最为传统的方法是基于最小抑制浓度药敏试验 37. 药敏试验是根据美国临床标准委员会 CLSI 推荐的 K-B 琼脂法 ， 把待测菌株接种到琼脂平板上进行培养 ， 再将浸有
25、一定浓度的抗生素滤纸片贴在纯菌落生长的平板上 ，待纸片周围出现无细菌生长区 ， 即抑菌环时 ， 测定抑菌环直径 ， 据此评估细菌对抗生素的抗性 . 目前 ， 评价细菌对抗生素的抗性强弱大都采用此方法 14， 21， 38.但纸片药敏试验法具有耗资 、耗时和耗人力的缺点 . Watkinson 等 39发明了一种快速评估地表水中细菌抗性的方法 ， 即用浸入了抗生素的修正选择性培养基快速评估大肠杆菌对抗生素的抗性 . 具体步骤是 : 在添加了荧光物质的新型 MI 培养基中 ， 首先按最小抑制浓度浸入抗生素 ， 再接种待测大肠杆菌样品 ， 由于后者体内的酶可分解培养基中的荧光物质并在紫外光下显示蓝色
26、 ， 故可通过计算蓝色菌株数目来判断抗性水平 . 此方法可在 24 h 内完成测定 .通过微生物抗性表型研究抗性的方法需鉴定耐药微生物的种属类型 ， 据此了解抗性宿主的特征 . 微生物种属的鉴定方法很多 ， 如传统的生理生化鉴定法可对细菌的种属进行鉴定 . 随着微电子和分子生物技术的发展 ， 微生物种属的鉴定方法和技术也得到了相应扩展 ， 如 Woese 建立的 16S rRNA/rDNA 基因序列分析法和 Biolog 全自动和手动细菌鉴定系统等 ， 与传统的生理生化鉴定法相比 ， 不仅简单 、省时 、省事 ， 而且准确性好 、敏感性高 . 目前常用的抗性细菌鉴定方法是将 16S rRNA
27、细菌鉴定法和 Biolog 法结合 ， 经 PCR 扩增后 ， 通过 16S rRNA 基因测序判断细菌的属 ， 再通过 Biolog 法确定细菌的种 .判断微生物对抗生素的抗性水平主要依据抗性微生物占总微生物的百分比 . 常用的估算细菌总量的方法是最大可能数法 ( most probable number，MPN)， 它是应用概率理论来估算细菌浓度 . 具体步骤是 : 将待测样品做一系列稀释 ， 直到将少量样品液接种到新鲜培养基时没有或极少出现生长繁殖 ， 根据没有生长的最低稀释度和出现生长的最高稀释度 ， 采用 “最大近似值 ”理论计算样品中单位体积细菌数的近似值 .3. 2 采用 PCR
28、 法研究抗性基因传统的通过细菌培养来判断抗性的方法在细菌抗药性研究中发挥了很大作用 . 但因对环境中许多微生物的最适生长温度 、pH、氧和营养成分等不十分清楚 ， 故难以用平板培养 . 因此 ， 以传统的微生物培养方法评价抗性 ， 难免会低估了诸如污水处理厂和水生生态系统等复杂微生物群落中的抗性微生物总量 .当前 ， 由于分子生物学手段的发展和分子示踪技术的不断完善 ， 在方法学上为将其应用于抗生素抗性基因的研究提供了极大可能 . 聚合酶链式反应PCR( polymerase chain reaction) 技术是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 片段的方法 ， 反应原理与细胞内 DNA
29、 复制相似 ， 但其反应体系要简单的多 . 它可直接检测微生物或环境样本中的抗性基因 ， 不需要对微生物进行分离培养 . 该方法快速 、灵敏 、准确 ，能将目的基因扩增放大几百万倍 ， 目前已在抗生素抗性研究中得到了广泛应用 .PCR 是目的基因的体外复制过程 . PCR 前对环境样品中目的基因进行提取纯化 ( 即 DNA 提取 ) 的方法主要有细胞抽提法和直接溶解法 . 前者是指先将微生物从环境介质中分离出来 ， 再提取 DNA， 该方法不但费时 ， 而且由于绝大部分细菌仍吸附在基质上 ， DNA 的损失率也较大 . Ogram 等 40提出了通过直接裂解细胞来释放 DNA， 即直接溶解法
30、， 它不需要分离细胞 ， 可直接通过物理 、化学或酶的作用来裂解细胞 . 该方法较方便省时 ， 且大量微生物及吸附在有机矿物基质上的微生物细胞均可被裂解 ， 因此不仅提取 DNA 得率高 ， 而且能较真实地反映样品中微生物的群落状态 . Tsai 等 41采用直接提取法获得的 DNA 得率是细胞提取法的 50 倍 . 直接溶解法在环境样本的 DNA 提取中得到了广泛应用并发挥了重要作用 .目前 ， 使用试剂盒提取微生物 DNA 的应用最多 ， 其原理是 ， 在特定溶液环境下 ( 高盐 、低 pH) 使核酸吸附在固相介质 ( 一般是硅胶膜 ) 上 ， 经洗涤去除杂质后 ， 通过改变溶液环境使 D
31、NA 溶解到纯水或TE 缓冲液中 . Knapp 等 42使用 MoBio UltraCleanSoil DNA kit( 一种 DNA 提取试剂盒 ) 直接从水样过滤器上提取 DNA， 再通过 PCR 扩增检测氧四环素对水样中四环素抗性基因的诱导作用 . Auerbach 等 15使用 FastDNA kit( 一种 DNA 提取试剂盒 ) 提取污水处理厂进水和出水中的四环素抗性基因 ， 以此研究6601 应 用 生 态 学 报 21 卷人类活动对活性污泥中四环素抗性基因的影响 .由于普通 PCR 技术不能做到准确定量 ， 故在此基础上结合荧光能量传递技术又发展了实时荧光定量 PCR( RT
32、Q-PCR) 技术 ， 它是通过荧光标记探针巧妙地把核酸扩增 、杂交 、光谱分析和实时检测计算技术结合起来 ， 然后借助荧光信号检测 PCR 产物 . 荧光标记物与扩增产物结合后 ， 被激发的荧光强度就与扩增产物量成正比 ， 从而可以实现精确定量 .RTQ-PCR 技术的发展和完善 ， 为研究环境中抗生素抗性基因提供了方法学上的可能 . 因此 ， 在分子水平上运用 RTQ-PCR 技术对环境中的 ARGs-DNA/RNA进行定量分析 ， 不仅结果更灵敏 、准确 ， 还能客观地表征环境中的抗性基因 .近年来关于应用 RTQ-PCR 技术定量表征环境样品中抗性基因的研究日益增多 ， 主要集中在对养
33、殖场废水 、城市污水 、河流沉积物和养殖场周围土壤中的四环素类 、磺胺类 、万古霉素等抗生素抗性基因的研究 43 44.作为 PCR 技术的补充 ， 目前也采用了其他一些方法检测抗性基因 ， 如 DNA 微列阵技术 ( microar-ray) 和变梯度凝胶电泳 ( PCR-DGGE) 技术等 .其中 ， DNA 微列阵技术的基本原理是基于Southern 杂交或斑点杂交技术 ， 用荧光或带有标记的 mRNA、基因组 DNA 探针与固定在玻璃片或尼龙膜表面上的成千上万个 DNA 克隆片段和人工合成的寡核苷酸片段进行杂交 ， 从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因 ， 进行 DNA 序列分
34、析等的一种新技术 . 近年来 ， 将 DNA 微列阵技术与 PCR技术结合来检测抗生素抗性基因的研究也日益兴起 . Call 等 45采用 DNA 微列阵技术监测了单个细菌体内的多种四环素抗性基因 . Patterson 等 46采用膜列阵技术对欧洲多个国家土壤及动物粪便样品中的四环素和红霉素抗性基因进行了检测 ， 发现膜列阵技术是筛选环境样品 DNA 从而鉴别四环素 、红霉素等抗性基因的有力工具 .PCR 产物可通过经溴化乙锭 ( EB) 染色的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测 ， 前者最为常用 . 现代生物技术的发展使检测技术逐步完善 ， 变梯度凝胶电泳 ( DGGE) 技术等广
35、泛用于微生物群落结构分析 ， 在抗生素抗性基因研究方面也有所开展 . 双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时 ， 其迁移行为决定于其分子大小和电荷 ， 因此不同长度的 DNA 片段在胶中能被区分开 ， 而同样长度的 DNA 片段因其在胶中的迁移行为一样 ， 不能被区分 . DGGE 技术的原理是在一般聚丙烯酰胺凝胶基础上 ， 加入变性剂甲酰胺梯度 ， 一个特定的 DNA 片段有其特定的序列组成 ， 其序列组成决定了其解链区域 ( melting domain， MD) 和解链行为 ( melting be-havior)， 变性剂浓度梯度可使 DNA 片段在解链区域发生解链 ， 因此序
36、列不同的 DNA 会在胶中的不同位置发生部分解链 ， 导致迁移速率大大下降 ， 从而将长度相同 、序列不同的 DNA 片段在胶中被区分开来 .PCR-DGGE 技术将 PCR 扩增后的目的基因通过变梯度凝胶电脉形成不同的单链 DNA 谱带 ， 测定谱带的碱基序列 ， 同基因文库中的 16SrDNA 序列比较 ，对抗性基因的来源微生物进行种属鉴定 ， 从而更好地了解抗性基因的来源 .4 抗生素抗性基因研究中存在的问题传统的微生物培养法因忽略了环境中大量的不可培养微生物 ， 难免会低估抗性基因的数量 . 现代PCR 检测技术可对抗生素抗性基因进行直接检测 ，虽解决了微生物培养受条件限制的缺陷 ，
37、但技术本身仍存在多种限制因素 ， 如模板 、引物 、DNA 聚合酶和温度等 . 此外 ， 实时荧光定量 PCR 还受其他因素影响 ， 如 : 引物二聚体 ， 它是非特异性退火和延伸的产物 ， 不仅影响扩增效率 ， 还因 SYBR Green I 可与所有双链 DNA 结合 ， 在反应体系中会出现特异性产物与引物二聚体竞争 SYBR Green I 的现象 ， 从而降低实时 PCR 敏感性 .鉴于 PCR 和实时荧光定量 PCR 技术等本身存在的问题 ， 在进行抗性基因检测时 ， 应根据需要对实验方案和基本参数进行优化 .采用传统 PCR 或 RTQ-PCR 成功检测抗性基因的关键仍然是模板和引
38、物的设计与选择 . 具体为 、模板必须纯化 ， 特别对于从环境介质中直接提取抗性基因的试验 ; 引物设计要合理 ， 不仅要求质量高而且要纯化 ， 在 RTQ-PCR 试验中有时还需设计探针 ， 但这会给引物设计增加难度 . 通常设计 RTQ-PCR 反应的引物和探针时 ， 除了满足一般引物设计要求外 ， 还应注意以下几点 : 引物序列和探针序列应尽可能靠近但不发生重叠 ; 引物和探针间既不能发生互补 ， 也不能形成稳定的发卡结构 ; 引物的退火温度 Tm 值较探针要低 10 左右 .此外 ， 利用 RTQ-PCR 对抗性基因进行定量时 ，定量方法的选择同样至关重要 . 其中 ， 模板定量有绝对
39、定量和相对定量两种表示方法 . 前者是指用已知标准曲线来推算未知样本量 ， 即将标准品稀释至不76014 期 王丽梅等 : 抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法同浓度后作为模板进行 PCR， 通过标准曲线确定未知样本量 ， 单位 ARGs copiesml1or mg1( 可以解释为单位体积环境样品中所含的抗性基因拷贝数 ) . 绝对定量在环境介质中表征 ARGs 数量时发挥了重要作用 ， 特别是在不同环境介质中研究 ARGs时起到了不可替代的作用 . 后者是在绝对定量的基础上引入了管家基因 16S rRNA( 一种原核生物rRNA)， 将目的基因和 16S rRNA 同时进行 PC
40、R， 由于管家基因 16S rRNA 相对恒定 ， 可用来指示环境中微生物的种类数 ， 因而相对定量的单位 ARGscopies/16S rRNA copies 表述为样本中目的基因的绝对数量相对于管家基因 16S rRNA 绝对数量的变化 ， 代表的是每个微生物细胞中所含的抗性基因的数量 ， 可定量表示抗生素对抗性基因的诱导率 ， 应结合研究需要将绝对定量和相对定量两种表示方法互相结合 、补充 .综上所述 ， 在研究抗生素抗性基因时应根据试验目的选择合适的方法 . 微生物培养法虽存在缺陷 ，但耐药微生物作为抗性基因最重要的宿主 ， 其环境行为很可能直接对抗性基因产生影响 ， 因此对环境中抗性
41、基因的研究不能忽略环境因素 ( 如温度 、pH和氧等 ) 对特定微生物类群的影响 .5 研究展望目前 ， 尽管大量文献报道了关于抗生素抗性基因的研究 ， 但研究结果只局限于在水环境 、土壤环境或食物中发现或检测到抗性基因 ， 有关其在环境中的来源 、分布 、传播和扩散机制及控制对策等仍不清楚 . 因此 ， 对未来抗生素抗性基因的研究提出了以下几点建议 :1) 建议有关部门和公众重视抗生素抗性基因这类新型污染物 ， 在畜牧和水产养殖业等加大对其污染的研究 ， 并明确其从污染源向水环境 、土壤环境和大气环境等扩散和传播的分子机制 .2) 弄清抗生素抗性基因是否可以通过食物链和饮用水等途径进入人体内
42、以及进入人体后会通过什么机制产生危害 ; 创建检测环境中抗性基因的技术体系 ; 减轻基因污染对生态环境和人体健康的影响 .参考文献 1 Addison JB. Antibiotics in sediments and run-off watersfrom feedlots. Residue Reviews， 1984， 92: 1 28 2 Pruden A， Pei R， Storteboom H， et al. Antibiotic re-sistance genes as emerging contaminants: Studies inNorthern Colorado. Enviro
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