1、82 微生物学通报 微波法快速提取放线菌基因组DNA 徐平 李文均 徐丽华 姜成林 2003年30(4) (云南大学省微生物研究所教育部微生物资源开放研究重点实验室昆明650391) (华北制药集团新药研究开发中心石家庄o5oo15) 摘要：原有的放线菌基因组DNA提取方法费时、费力、费用高，且对极端环境放线菌成功 率较低。利用微波热振惊提取固体培养基表面放线菌菌落基因组DNA，具有快速、简便、 费用低廉等优点。所得的基因组DNA可作为PCR反应的模板进行16S rRNA基因有效扩增。 这为大量放线菌菌株的快速鉴别和系统分类创造了条件。 关键词：微波，基因组DNA提取，PcR，16S DNA
2、中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：02532654(2003)04-008203 A M匝CRoWA一B 疆D M nI()D DR GE】 )MlC I A E 【 ACI10N R0M AC11 C XU Ping LI WeJun XU Li-Hua JIANG Cheng-Lin (The go 0 Mcrobd Resources ofMnsOy ofF_duaat，Yunnan，n妇如ofMcrobdogy， Yunnan unay， 嘶650091) (New Research and Center ofNoah Ofha Phannacelahxd ，s ，0500
3、15) 吲 l吐：The商 methods O11DNA eXtIOtl are not only唧1 and expensive，but althoughinvalidwith ac6- nomyeetes under extzlEme environmtsC,enoncDNA can be extracted directlyfrombiompicked upfrom solidmedi- um by microwave thermal shock，The extracted DNA is suitable for PcILThe method is eedive，easy and fas
4、t，and can be usedin a五n0myode systematics andidentificationpiay X留-O s：Mim1w e， n0 cDNA酬ncIi0Il，PCR，16S rDNA 放线菌基因组DNA提取方法很多，可归纳为以物理方法破细胞壁再提取基因组 DNA和酶或化学法破壁提取DNA两种。前者如液氮研磨法、石英沙振荡研磨法等， 后者如改良Marmur法 等。但这些方法不仅步骤多、费时、菌体需要量大，而且对嗜 极端环境微生物难于奏效。因此有必要探索一种快速、高效的基因组DNA提取方法， 以满足大量菌种快速筛选和分类鉴定的需要。 Orsini等 利用微波热振惊
5、法直接提取土壤等环境样品的细菌基因组DNA。该方法 可迅速破细胞壁，然后以高浓度的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)可有效 提取基因组DNA。所得的DNA可作为PCR模板进行16S rRNA基因的有效扩增。 *国家科技部基础研究重大资助项目(No2001CC(X)0600) 云南省自然科学基金资助项目(No2001(X001Q) 云南省教育厅基金资助项目(No01111134，NoO2Qm7) 教育部微生物资源开放研究重点实验室开放基金资助项目 收稿日期：2002-07-24，修回日期：2002-09-09 维普资讯 http:/ 2003年30(4) 1材料与
6、方法 1-1材料 1-11 菌种：见表1。 1-12 试剂：洗涤液： 50mmolL Tris，pH77， 25mmolL ED1A， 01 PvP；裂解液：50mmolL Tris，pH8，25mmolL EDTA， 3SDS，12PvP；抽提 液：10mmolL Tris，pn8， 1mmolL EDTA，03molL NaAc，12PvP PVP40，000为AMRF_S CO公司产品， 酶购自 微生物学通报 表1实验菌种 83 菌 种 菌号 云南双孢放线菌(Actinobispora ywmwumsis) CCIEC M90959 马杜拉马杜拉放线菌(dd nmnId口madurae)
7、 CG蕾CC 41178 产色小双孢菌(Microbispora duonogenes) JC,M 3022 青铜小单孢菌(Micromonospora 口zc) CGMCC 41050 白色类诺卡氏菌(Nocardodes abus) CGMCC 41183 星状诺卡氏菌(Nocarda asterodes) CGMCC 41165 自养假诺卡氏菌(Pseudonooardia 觑口) CCRC 12444 绿色糖单孢菌(Saa：haromopora vrds) CGMCC 41089 披发糖多孢菌(Saodmmpoyspora hrsuta) CGMCC 41317 灰色链霉菌( ) AT
8、CC 23345 吸水链霉菌(3trptomyces hygroscopiots) CGMCC 4940 弯曲高温单孢菌(pora ) NRRLB-1983 *缩写：ATCC=美国典型菌种保藏中心，JCM=日本微生物保藏中心。 NRRL=美国农业研究菌种保藏中心，CCRC=中国台湾菌种保藏及研究 中心，C,MCC=中国普通微生物菌种保藏管理中心，CCICC=中国典型 菌种保藏中心 TaKaRa公司。16S rDNA扩增用PCR引物(引物A，8-27f：5AGAGTITGATCC TGCycr- CAG-3；引物B，15231504r：5AAGG AGGTGA1CAGCCGCA3)由TaKaRa
9、公司合 成。微生物培养用ISP2固体培养基。 1-2方法 121菌体准备：用无菌竹签从固体培养基上挑取单菌落或少些菌苔于无菌安瓿管， 备用。 122 DNA提取：在装有菌体的安瓿管中加入洗涤液lmL，在旋涡混合器上振荡5s； 5，700rmin离心lmin；弃上清；加入35 裂解液，振荡悬浮，并于功率为600W微波炉 中处理60s；加入400uL 65预热 的抽提液，振荡5s；加入等体积 的Tris饱和酚氯仿溶液抽提， 10，000rrain离心5rain；上清以等 体积的异丙醇沉淀，70乙醇洗 涤，干燥后溶于2O TE溶液中。 123基因组DNA检测t取10 DNA溶液于08琼脂糖凝胶50V
10、 电泳15h，260nln紫外灯下观察并 照相。 124 16S rDNA PCR扩增：将提 取的基因组DNA作为模板进行 PCR扩增。25 反应体系包括 DNA， 200mmolL dNTP，1 图1微波法提取的放线菌基因组DNA电泳图谱 1云南双孢放线菌CCTCC M90959，2 自养假诺卡氏菌CCRC 12444，3绿色糖单孢菌CGMCC 41089，4披发糖多孢菌CGMCC 41317，5星状诺卡氏菌CGMCC 41165，6青铜小单孢菌CGM CC 41050，7白色类诺卡氏菌CGMCC 41183，8产色小双孢菌 X Iq DNA聚合酶buffer，1 Taq JC,M 3O22
11、，9马杜拉马杜拉放线菌CGMCC 41178，10弯曲高温 酶，100pmol引物。反应在Thermo单孢菌NRRL B-1983，l1灰色链霉菌ATCC 23345，12弯曲高温 崎d PCR仪上进行，程序为单孢菌cGMcc 494o， T 4 维普资讯 http:/ 84 微生物学通报 2003年30(4) 94变性5min，94变性lmin，56C复性lmin，72延伸2min进行30个循环，72 延伸5min。取5 PCR产物在1琼脂糖凝胶50V电泳15h，26Ohm紫外灯下观察并照 相。 2结果与讨论 为了验证微波法抽提DNA的有效性，我们选用11个属的12种放线菌进行试验 (表1)
12、。单个菌落的菌体量既足够用于基因组DNA的提取。所得的基因组DNA电泳后 在19kb以上的位置可见一明显的DNA带。泳道上没有发现DNA降解现象(图1)。 以此DNA为模板进行PCR反应，可有效扩增16S rRNA基因。扩增产物经电泳检测 目的条带特异，且产物量大，表明所提取的DNA中没有酶反应的抑制物存在(图2)。 微波法提取DNA时所需菌体 量极微，固体琼脂平板上的单菌 落即可用于基因组DNA的提取， 避免了菌体繁殖所需的时间。从 固体琼脂平板上挑取菌落时即使 混有一些琼脂也不影响DNA的提 取及所提DNA的质量。在微波法 提取DNA过程中，由于只需洗涤、 微波振惊破壁和酚氯仿抽提等3 图
13、2微波法提取的放线菌基因组DNA为模板 步反应，有效避免了物理破壁的 的16S DNA PCR产物电泳图谱 费时、费力或酶法破壁中的长时 云南双 放 cc c ， 自养假诺 氏菌cCRC间消化处理过程。同时微波法提 M CC413 17，绿色5 Cc4GMJC C：11645，披6发 差 取DNA过程中所用的试剂都是常 ， 星状诺卡氏菌 4 ， 青铜小单孢菌一 “ 0 CGMCC41050，7白色类诺卡氏菌CGMCC 41183，8产色小用、价廉的生化试剂，微波炉和 双孢菌JCM 3O22，9马杜拉马杜拉放线菌CGMCC 41178，10 台式离心机也是实验室常备仪器。 弯竺苎 苎 983，灰
14、色链霉菌A1c 23345，12因此微波法与常规的DNA提取方 弯曲高温单孢菌CGMCC 4940，13 M)NMEco T14I 一 。 一 法相比，具有简便、高效、快速 和价廉等特点。微波DNA提取法的建立为大量菌株的快速鉴别和活性物质产生菌的快 速基因筛选奠定了基础。 参考文献 1Hopmod D H，Bibb M J，aIat盯K F，甜 Genetic Ma|li of Streptomyces A Iaratory删吼 In hep蛐日tiof ehroill06(i，plasmid and DNANorwich：FCroweSonslad1985，798o 2放线菌 分类匕同定日本放线菌学会编200183 88 3OrsiniM，RI spjcaVLettXpplMiembiol，2001，33：1720 维普资讯 http:/
