1、现代技术在昆虫学中的应用摘 要：现代生物技术在昆虫分类和昆虫生态学的研究中具有广泛的应用,综述了近年来生物技术(如同工酶电泳、PCR、RFLP、RAPD、核酸序列分析、探针杂交等)在昆虫分类学领域的应用情况，及其在鉴定害虫抗药性、滞育机制以及昆虫与植物之间关系等中的应用。关键词：生物技术；昆虫学；应用Abstract: Modern biotechnology has wide application in the study of insect taxonomy and ecology of insects. This paper summarizes the application of
2、recent year biological technologies such as EST isozymes, PCR, RFLP, RAPD, DNAfp nucleic acid sequence analysis and probe hybridization, etc. Modern biological techniques applied in diapause mechanism, relationships between insects and plants, and kin recognition etc.Key words: biotechnology; insect
3、; application20 世纪 70 年代以来,先后出现了同工酶测定、DNA 探针及指纹图谱、RAPD、RFLP 、mRNA 差异显示和基因测序等多种现代生物技术。目前,这些技术已广泛应用于昆虫分类学、昆虫生态学,极大地促进了昆虫分类学、昆虫生态学的发展,使得昆虫分子系统学、昆虫分子生态学的研究成为可能。1.生物技术在昆虫分类中的应用1.1同工酶电泳技术从上世纪 70 年代开始,同工酶的研究已成为鉴定物种和种间亲缘关系等方面的重要方法。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对不同分类单元之间的昆虫进行酯酶同工酶的研究,可以利用其生化特征的差异来推测不同分类单元间物种在基因水平上的不同,以此来推断它
4、们的血缘关系和进化地位。邹平等 1采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对云南松纵切坑梢小蠹四个地理种群同工酶进行比较,并讨论了它们的亲缘关系。韩雅莉等 2对 9 种蝗虫的酯酶同工酶进行研究,发现9 种蝗虫都有各自特有的酶带。目前,酯酶同工酶(EST)电泳技术是昆虫分子系统学中常用的方法之一。很多研究表明,酯酶同工酶在低级分类阶元中具有分类鉴别特征,同一属分类阶元中各个种间的酯酶同工酶谱带相似程度明显高于不同属分类阶元之间的相似程度;较高分类阶元之间酯酶同工酶谱带相似程度低于较低分类阶元之间的相似程度。1.2 PCR技术PCR 是聚合酶链式反应，目前这一技术在分子生物学领域获得了广泛的应用,在
5、很大程度上代替了传统的 DNA 克隆方法,同时在昆虫学领域也得到了广泛应用。如 Paskewitz3用 PCR 技术识别按蚊种类。康巧华等 4用低 G/C 含量的引物,通过 PCR 技术扩增了家蝇细胞色素 P450 的 cDNA。李正西等 5利用 PCR 技术对澳洲赤眼蜂、甘蓝夜蛾赤眼蜂、食胚赤眼蜂、广食胚赤眼蜂和松毛赤眼蜂等 6 个地理种群进行了分类鉴定。目前根据特定的氨基酸序列,借助 PCR 技术和合引物扩增基因片段作为探针构建不同昆虫的 DNA 库,得到完整的 cDNA 分子,是昆虫分子生物学领域的研究热点之一。1.3 RFLP技术RFLP 是限制性片段长度多态性，其原理是利用限制性内切
6、酶消化目的DNA,电泳分离限制性酶切片段,用探针与限制性内切酶消化产物进行杂交,通过放射自显影或免疫荧光技术检测与探针互补的 DNA 序列。RFLP 是由于核酸序列不同而造成 DNA 限制性片段之间等位基因差异的结果。使用这种方法可以发现两条同源染色体上的限制性片段。RFLP 的优点在于它能直接发现同源染色体上核苷酸碱基序列的差异,与传统的形态学和生物化学标记不同的是, RFLP分析与基因表达无关。RFLP 数量多,受环境和遗传背景影响小,在发育过程中稳定。该方法适用于微量 DNA 的分析研究,目前典型的 RFLP 研究都选择 mtDNA进行。对于昆虫来说,目前大多数 mtDNA 的限制性片段
7、长度多态性研究都是在种内或近缘种间进行,而科、属等高级阶元间的分析较少。赵惠燕等 6在同翅目昆虫的分类方面应用了这样的分析方法。Chapco 7用同样的方法研究了 11 种蝗虫之间的演化关系。应用 RFLP 分析方法,使传统的昆虫分类区系及系统进化研究获得了新的发展和飞跃。1.4 RAPD技术RAPD 是随机扩增多态 DNA 分析，以 PCR 为基础的一项 DNA 分子水平上的大分子多态检测技术。其原理是用随机序列的 910 个核苷酸的引物,对基因组的 DNA 进行 PCR 扩增,再进行电泳分离和溴化乙锭染色。目前 RAPD 技术已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法,该技术一出现,就被用于蚊
8、虫的分子系统学研究。Black 等 8将 RAPD 技术用于四种蚜虫的鉴别比较。他们用 4 种10 个碱基的随机引物对四种蚜虫进行了 RAPD 反应,检测它们扩增产物的多态性,结果表明根据图谱能明确地区别四种蚜虫。蒋国芳,陆敢等 9应用 RAPD 技术对在广西分布的 5 种蚱蝗的 DNA 多态性进行研究,并确定了它们互相间的亲缘关系。张素芳,程家安等 10用 RAPD 技术对桃蚜雌性母蚜、雄蚜、卵、干母、干雌和有翅迁移蚜等全周期生活史型进行遗传性多态分析,表明卵的 DNA 多态性最大,性蚜次之,孤雌生殖蚜最少。1.5核酸序列分析技术核酸序列分析技术是通过测定核酸分子一级结构中核苷酸序列来比较不
9、同分子之间的相互关系,从而阐明基因组 DNA 一级结构上的遗传信息是如何控制生物三维形态发育和复杂性不断增加的动态过程,并从遗传学角度对生物的分类、系统发育和进化作出解释。由于 rRNA 在昆虫中容易分离,且进化速度慢,因此在科、属等高级分类阶元的系统发育时,用 rDNA 和 rRNA 片段。通常用进化较快的 mtDNA 片段,确定种内或近缘种的系统发育关系。曹功杰 11对 7 种昆虫的 5S rRNA 结构特点进行了比较研究。Chapco 12应用核酸序列分析方法对直翅目 11种蝗虫的进化关系进行了研究。罗晨,姚远等 13利用 mtDNA COI 基因段片标记,采用序列分析的方法,从分子生态
10、角度研究近年来我国暴发危害的烟粉虱 5 个种群的生物型,结果表明我国烟粉虱实验种群的生物型与 Texas-B 型和 Arizona-B型种群为同一生物型 B。目前在昆虫分子进化和分子系统方面,用核酸序列分析技术测定昆虫特定DNA 和 RNA 序列,比较不同昆虫类群个体的核苷酸顺序 (同源核酸),据此推断不同昆虫类群之间的演化关系,建立符合自然发育的分子系统谱系,是昆虫系统发育的研究方向之一。同时通过测定 DNA、RNA 的核苷酸顺序 ,对昆虫进行分类并构建其系统发育关系,有望在昆虫鉴定方面发挥作用。1.6探针杂交技术核酸的分子杂交技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一。它的基本原理是核酸分
11、子杂交具有一定同源性的 DNA 单链或者 DNA 单链分子与RNA 分子,经其互补的片段在除弃变性条件后又可以恢复形成双链 DNA 分子或者 DNA/RNA 异质双链分子。在昆虫学研究主要通过核酸分子杂交技术检测遗传的多态性、DNA 的同源性和 mRNA 的差异来鉴别昆虫的近缘种以及地理种群。如 Collims14用 DNA 探针杂交鉴定按蚊属近缘种类。2.现代生物技术在昆虫生态学中的应用2.1鉴定害虫抗药性近年来,酯酶同工酶作为鉴别害虫抗药性的遗传变异手段已被广泛应用,在检测与害虫抗药性有关的变异方面,RAPD 技术也发挥了重要的作用,人们可在缺乏对抗药性基因深入了解的情况下,仍可依赖与抗性
12、基因连锁的 DNA 多态性标记对种群的抗性遗传变异进行鉴定。如芮昌辉等 15利用 RAPD 技术分析了棉铃虫对三氟氯氰菊酯的遗传方式;程罗根等 16用 RAPD 方法研究了小菜蛾(Plutella xylostella)对杀虫双和杀螟丹抗药性遗传 ,通过随机引物扩增,找出与抗性有关的遗传标记,为进一步研究抗性基因的分子结构和功能奠定了基础。2.2研究昆虫与寄主植物间的关系植食性昆虫和它们寄主间的密切关系对昆虫种群的遗传结构有着重要的影响。一种情况是寄主空间分布的不连续性,或亚居群对某种寄主的食性专化;另一种情况是,与寄主有关的亚群之间基因流的限制有助于种的适应性和对资源开发策略的进化。目前,同
13、工酶标记是研究基因流模型和昆虫种内种群和寄主间遗传分化程度的有用工具。谭六谦等 17研究了苹果、山楂、枣 3 种寄主上桃小食心虫(Carposina saskii)的酯酶同工酶,结果表明,在不同的寄主上存在着明显的生理分化,认为形成了“生理宗”和“食物宗”;杨效文等 18研究了烟蚜(Myzuspersicae 不同地理种群和寄主种群的分化 ,结果表明 ,我国烟蚜分化仅在种群水平上,未达亚种分化程度;Gonzlez-Rodrguez 19利用此技术分析了采自不同寄主和地理区域的 2 种菜豆(Acanthoscelidesobtectus 和 A.obvelatus),分析了寄主地理分布的基因差异
14、。2.3研究昆虫滞育机理滞育是昆虫中广泛存在的一种受遗传控制的生长发育停滞的现象,它是调节植食性昆虫的生活史与寄主植物物候期同步,躲避不良环境条件的重要生态学机制。研究表明,光周期是诱导、维持和终止滞育的主要因素,温、湿度与食料起着辅助和伴随作用。随着生物化学和现代分子生物学的飞速发展和在昆虫学研究中的应用日益普及,对昆虫滞育的研究取得了突破性的进展。如薛芳森等 20研究表明,黑纹粉蝶(Pieris melete)滞育蛹在滞育期间,过氧化氢酶 (CAT)活力与温度密切相关,越夏蛹在越夏期间 CAT 活力处于低水平是夏季高温所致,而越冬蛹在越冬期间 CAT 活力处在高水平是冬季低温所致,且滞育蛹
15、的过氧化氢酶活力明显低于同期的非滞育蛹。另外,关于滞育蛋白和滞育激素 mRNA 的研究等,更加深入地揭示了滞育现象的本质,为今后进一步通过调节昆虫的行为习性防治害虫奠定了一定的基础,开辟了害虫防治的新途径。3.小结利用现代生物技术对昆虫分类的研究,促使研究方式由表及里,由宏观向微观转变。随着现代生物技术的迅速发展,实验技术的不断发展和改进,它必然会推动昆虫学在分子水平上的发展。昆虫分类学是昆虫学研究中的基础领域,也是传统领域,可以预见在不远的将来,古老的昆虫分类研究随着不断创新的理论和技术的发展,将有新的更大的成就。现代生物技术的发展加速了昆虫生态学在微观领域的研究,改变了传统的由宏观到微观、
16、由个体解剖到组织系统、由有机体水平到细胞水平、由遗传表现到基因型的研究方法,生物技术手段从蛋白质及基因结构与功能出发去阐明复杂的生命现象,其简便快捷的研究方法大大加速了生命科学研究的进程,使一些利用传统方法和理论无法解释的生命现象得以从其遗传机理方面得到解释。分子生物学技术在昆虫生态学中的应用尚处于起步阶段,已逐渐运用于昆虫生态学研究的各个方面,它将为昆虫生态学的研究发挥巨大的作用。参考文献：1 邹平, 叶辉 . 云南松纵切坑梢小蠹四个地理种群同工酶比较研究J. 遗传, 1999, 21(6): 27-31.2 韩雅莉, 谭竹均. 网翅蝗科九种蝗虫的酯酶同工酶研究J. 昆虫分类学报, 1999
17、, 21(2): 87-92.3 Paskewitz S M. Evoluation of the polymerase chain reaction method for identifying member of the Anopheles gambiae complex in Southern Africa J. J. Med. Entomol, 1993, 30(5): 953957.4 康巧华 , 陈年春, 周顺伍 . 用低 G/C%含量引物通过 PCR 技术扩增了家蝇细胞色素 P450 的 cDNAJ. 昆虫学报, 1998, 41(3): 225-230.5 李正西, 沈佐锐.
18、RDNA-ITS2 应用于赤眼蜂分子鉴定研究J. 中国农业大学学报, 2002, 7(5): 80-84.6 赵惠燕,袁锋,张改生.18与同翅目昆虫的分类系统 .西北农业学报,1997,6(2):102-105.7 Chapco W. Mitochondrial DNA varation in North America mekanopline grasshoppers J. Heredity, 1994, 72(2): 19.8 Black IVW C.Use of the random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction
19、(RAPD-PCR)to detect DNA polymorphisms in aphids J. Bull Entomol Res, 1992, 82: 151159.9 蒋国芳 , 陆敢, 黄琨, 等. 用 RAPD 标金研究蚱蝗五个种间的亲缘关系J. 昆虫学报, 2002, 45(4): 499502.10 张素芳, 程家安, 杨效文 . 桃蚜不同蚜型 DNA 多态性的 RAPD 研究J. 昆虫学报, 2002, 45(6): 764 769.11 曹攻杰 . 数种昆虫 5SrRNA 结构特点的比较J. 昆虫学报, 1988, 31(3): 229235.12 Chapco W.Mit
20、ochondrial DNA varation in North America mekanopline grasshoppers J. Heredity, 1994, 72(2): 19.13 罗晨, 姚远, 王戊疆 , 等. 利用 mtDNA COI 基因序列鉴定我国烟粉虱的生物型J. 昆虫学报, 2002, 45(6): 759763.14 Collins F H. A rDNA probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex J. Am. J. Trop. Med. Hyg, 1987, 37:
21、3741.15 芮昌辉, 赵建周, 卢光美, 等. 棉铃虫对三氟氯氰菊酯抗性的遗传方式及RAPD 分析A. 见: 邱式邦. 中国植物保护研究进展C. 北京: 中国科学技术出版社, 1996. 653-657.16 程罗根, 李凤良, 韩招久, 等. 小菜蛾对杀虫双和杀螟丹抗药性遗传的 DNA随机扩增多态性研究J. 昆虫学报, 2001, 44(1): 15-20.17 谭六谦, 王光香. 不同寄主桃小食心虫酯酶同工酶的比较研究J. 落叶果树, 1989(3): 21-23.18 杨效文, 张孝羲, 陈晓峰 , 等. 我国烟蚜种群分化的 RAPD 分析J. 昆虫学报, 1999, 42(4):
22、372-380.19 Gonzalez-Rodriguez A, Betty B, Castaneda A. Population genetic structure of Acanthoscelides obtectusandA. Obvelatue (Coleoptera:Bruchidae) from wild and cultivated Phaseolussp p. (Leguminosae)J. Annals of the Entomological Society of America, 2000, 93(5): 1100-1107.20 薛芳森, 魏洪义, 朱杏芬. 黑纹粉蝶滞育蛹体内过氧化氢酶活力的研究J.植物保护学报, 1997, 24(3): 204-208.
