1、第三节 酶标记物的制备,一、酶制剂及其底物,作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1) 活性高(2) 性质稳定(3) 专一性强(4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5) 方法敏感，重复性好，简单易行(6) 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。,辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP),HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。 HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%
2、。 HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH39,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。 高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。,HRP酶促反应,酶促反应的过程：HRPDH2H2O2D2H2O 供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外，还有一种供氢体称ABTS2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，灵敏度和稳定性均好。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂
3、，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。,HRP常用底物,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，,ALP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。 小牛肠粘膜ALP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；大肠杆菌ALP分子量为80kDa，最适pH为8.0。 ALP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基苯磷酸盐(PNP)、-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。 ALP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。ALP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。,ALP常用底物,作为酶标记对象的抗原与抗
4、体要求：,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,二、酶结合物的制备方法,制备方法要求： （1）技术方法简单、产率高，重复性好； （2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性； （3）酶标记物稳定 ，不形成聚合物。,几种常用标记方法比较,（一）过碘酸盐氧化法,原理： HRP是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位-0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG偶联物。 所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和IgG结合，99的Ig与
5、酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前最常用的方法。,1、HRP标记腹水单抗,过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中；2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h；3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀；4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀；5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h；6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中；7、用少许PBS将交联物全部洗出；8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作
6、用30min；9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；,10、将交联物过Sephdex G200（2.6100cm）层析纯化，分管收集第一峰。,Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min.,（二）戊二醛交联法,原理：戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两
7、个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。 戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。 戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。,HRP标记多抗,1、取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20左右）反应结合18h。 2、用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4透析过夜。 3、将5mg抗体Ig
8、G溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。,4、加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.09.6），4，电磁搅拌下结合24h。 5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。 6、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液。 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点：酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。,三、标记抗体质量判定,（2）定量和克分子比值测定：分
9、光光度计测定(光程1cm) 酶量(mg/ml)OD403nm0.4 IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm 0.3)0.62(过碘酸盐) IgG量(mg/ml)(OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62(戊二醛)酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量 HRP/IgG (摩尔比) 4 40,000 160,000 IgG量 标记率 = OD403nm/OD280nm,用于ELISA酶标抗体的各项指标参数,直接ELISA法测HRP-IgG效价,采用直接ELISA法测定酶标单抗效价，以特异显色为1.0时的稀释倍数作为酶标单抗效价。,四、标记抗体保存,加等量甘油后，小量分装-20存放 加等量60%甘油4保存 以BSA或脱脂牛奶作保护剂，冻干保存,
