1、如何 避免 免疫 共沉淀（ Co-immunoprecipitation， Co-IP） 中 的 igG交叉 反应 赵晋平 蛋白质 相互 作用 技术 已经 为 越来 越多 的 研究者 所应用， 其中 免疫 共沉淀（ Co-immunoprecipitation， Co-IP） 作为 一种 最受 认可 的 蛋白 质 相互 作用 方法，且 结果 被最为 广泛 的 杂志 和 审稿者 所 接受。 在 权威 的 国际 杂志中 甚至 被要求 作 为必须 和 唯一 的 可靠 结果 。 在植物 分子 生物 学 研究 中， 标签 蛋白 抗体 的 免疫 共沉淀 相比于 特 异 单抗 具有更为 灵活 的 应用 范
2、围 ， 并 节约 大量 工作 时间 （ 毕竟 时间 是 最 宝贵 的 ） 。 鉴于 在 Co-IP 实践中 ， 很多 同仁 会遇到 igG交叉 反应 的 困扰。 在此， 笔者 将多年 总结 的 些许 经验 进行 汇总， 其中 包含了 无数次 的 失败 及调整 后的 成功。 期望为 兢兢业业 的 奋战在 科研 道路 上 的 同仁 提供 点滴 帮助， 则 不甚 荣幸 。 igG 的 轻 /重链 在 25kD/50kD， 由于 SDS/PAGE 电泳 的 原因 也会 发生 =1:10,000）。 当 交叉 反应 不甚 严重 时， 此方法 最为 经济 有效。 评级： AA。 2. 一抗 /二抗 同时
3、添加 ， 一步 法 完成 WB。 本人 没有 亲自 实验， 据说 有时 有效 ， 但是 要 调整好 比例。 有这样 的 时间 ， 不如 参考 以下 的 方案 了 ： P。 评级 ： AA。 3. IP/WB采用 不同 来源 抗体 ， IP 为 鼠源， 则 WB可采用 兔 抗 或 人抗。 效果一般， 如果 有条件 采用 混合 单抗 （ 不同 细胞株 ） 进行 IP， 尚 不失 为一种解决 方法。 评级： AA。 4. 采用 特异性 识别 igG 轻 链 或者 igG 重 链 的 二抗 ， 如果 目的 蛋白 与 igG 轻链 接近， 则采用 重链 二抗， 反之 亦然。 目前 有 多 个 公司 提供
4、 HRP标记 的轻重链 特异 抗体， 效果 不错。 评级： AAA。 5. 采用 仅识别 igG 天然 构象 的 二抗 ， 由于 二抗 只是 识别 天然 构象 的 一抗，而 PVDF 膜 上 结合 的 变性 igG 结合 能力 极低， 这可以 算是 一步 到位 的 解决 方案， 目前 有限 几家 公司 有售 ， 谷歌 一下 。 评级： AAAA。 6. 采用 标记 一抗 ， 非常好 用， Cell Signaling抗体 值得 一试。 评级 ： AAAA。 下面 的 方法 ， 我们 考虑 采 取 更为 有效 的 解决 手段。 由于 igG在 煮沸 过程 中 随 目的一起 与 支持物 分离， 进
5、而 在 后续 的 WB 实验 中 产生 交叉 反应。 因此， 可以 将煮沸 的 过 程 变为 洗脱， 就可以 除 去 igG的 影响 了。 1. 采用 低 pH洗脱 ， 与 重复 使用 同一张 PVDF膜类似， 低 pH值 （ 2.0） 会降低 抗体 /抗原 相互 作用， 从而 将 抗体 抗原 分离 （ 0.1 M 甘氨酸 ， pH 2.5 to 3） 。 一定 要 在 电泳前 平衡 pH （ TrisCl, pH 9.5, 1/20体积 ） 。 评级： AAAA。 2. 采用 竞争性 段 肽 洗脱， 比如 HA， Myc， Flag等 多肽， 价格 比较 便宜， 竞争性 效果 好， 非常 适用于 标签 抗体 的 Co-IP。 多 肽 可以 合成， 许多 公司 如生工， sigma有售。 推荐 采用 这种 方法， 评级： AAAAA。 草 书 至此 ， 望 同仁 赐教， 将不断 补充 更正。
