1、安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）1探讨生物固氮在农业生产中的应用1、绪论氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是农业生产中必不可少的肥料。在大气中分子态氮约 79%，不能为大多数生物（包括所有植物和动物）直接利用；而地球水圈和土壤含有相当数量的硝态氮，可绝大部分在海洋中，难以被生物有效利用，限制了生物体的发展。生物界氮素输入的最主要物质形式是大自然含量极低的氨态氮（铵离子） ，因此氨态氮的供应成为生物界繁荣发展的主要决定因素。自然界中，氨态氮的来源主要就是通过固氮作用（分子态氮被还原成氨及其他氮化物的过程称为固氮作用） 。固氮作用有两种方式：一是非生物固氮，即通过闪电高温放电等现象固氮，
2、这样形成的氮化物较少；二是生物固氮，即通过微生物的作用固氮，这样形成的氮化物占 90%以上。1.1 生物固氮的基本概念空气主要由氧气和氮气组成，其中氮气约占 4/5。在自然界的千万种生物中，有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮。1.2 生物固氮的优点固氮量大 1据联合国粮农组织(FAO)1995 年估计,全球每年由生物固定的氮量接近 2 亿吨 1,相当于地球上每年固氮总量的 70%。有利于生态环境保护 2据调查,我国施用的化肥总量约占世界的 35%。盲目过量地生产和施用化肥,不仅容易引起水、土壤和大气等的污染,还容易使一些
3、有害物质通过食物链进入人体,造成二次污染.相比之下,生物固氮则有利于生态环境的保护和农业的可持续发展.可以预测,生物固氮将是未来绿色农业的主要肥源之一。成本低 3据预测,本世纪 30 年代我国人口将达到 16 亿,年需粮食约 6.4 亿吨,相应地需要投入尿素 6400 万吨左右。届时,为了满足粮食生产对氮肥的需要,至少需要新建年产 30 万吨的尿素厂 100 座 1。建设这些化肥厂的投资无疑十分巨大,而安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）2且,在化肥厂投入运营后,还将消耗大量的不可再生资源(如石油)和电能。反应条件温和 4工业合成氨需要在高温高压下进行,生产工艺复杂。而生物固氮在常温常
4、压的自然条件下即可进行。此外,生物固氮还具有肥效持续时间长等优点。1.3 自然界中三种生物固氮1.3.1 自 生 固 氮自生固氮微生物在土壤或培养基中生活时，可以自行固定空气中的分子态氮，对植物没有依存关系。常见的自生固氮微生物包括以圆褐固氮菌为代表的好氧性自生固氮菌、以梭菌为代表的厌氧性自生固氮菌，以及以鱼腥藻、念珠藻和颤藻为代表的具有异形胞的固氮蓝藻（异形胞内含有固氮酶，可以进行生物固氮） 。1.3.2 共 生 固 氮共 生 固 氮 微 生 物 只 有 和 植 物 互 利 共 生 时 ， 才 能 固 定 空 气 中 的 分 子 态 氮 。共 生 固 氮 微 生 物 可 以 分 为 两 类
5、： 一 类 是 与 豆 科 植 物 互 利 共 生 的 根 瘤 菌 ， 以 及与 桤 木 属 、 杨 梅 属 和 沙 棘 属 等 非 豆 科 植 物 共 生 的 弗 兰 克 氏 放 线 菌 ； 另 一 类 是与 红 萍 （ 又 叫 做 满 江 红 ） 等 水 生 蕨 类 植 物 或 罗 汉 松 等 裸 子 植 物 共 生 的 蓝 藻 。由 蓝 藻 和 某 些 真 菌 形 成 的 地 衣 也 属 于 这 一 类 。1.3.3 联 合 固 氮有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能够生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等植物根内的皮层细胞之间。这些固氮微生物和共生的植物之间具有一定的专一性，但是不形成根
6、瘤那样的特殊结构。这些微生物还能够自行固氮，它们的固氮特点介于自生固氮和共生固氮之间，这种固氮形式叫做联合固氮。1.4 生物固氮的固氮原理及机制1.4.1 固氮原理1982 年，Postgate 以肺炎克氏菌（Klebsiel-lapneumo-nlae，简称 Kp）为例提出一个固氮酶催化机理模式，至今仍被广泛采用。其总反应式为： N2 + 8e- + 8H+ + 16MgATP + 16H2O 2NH 3 + H2 + 16MgADP + 16Pi安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）3固氮微生物的固氮过程是在细胞内固氮酶的催化作用下进行的。不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情况基本
7、相同。在固氮酶将 N 还原成 NH3的过程中，需要 e-和 H+，还需要 ATP 提供能量。生物固氮的过程十分复杂，简单地说，即在 ATP 提供能量的情况下，e -和 H+通过固氮酶传递给 N2，使它们还原成NH3，而乙炔和 N2具有类似的接受 e-还原成乙烯的能力。1.4.2 固氮机制固氮生物虽然多种多样，但其固氮过程都需要固氮基因参与，固氮基因和固氮酶只存在于固氮菌体中，具有共生固氮特性的高等植物仅提供宿主条件，以使固氮效能能有效表达，通过遗传操作可以实现固氮基因在不同细菌之间转移。由此对固氮基因的位置、数目、结构和功能等方面有了深入了解。70 年代末在放线菌中发现了弗兰氏菌与多种非豆科植
8、物能共生结瘤并且有固氮效应，在被子植物中能与弗兰氏菌共生结瘤的非豆科植物皆为乔木或灌木等木本植物，他们不仅具有强大的固氮能力，而且还具有抗干旱（如沙棘） 、耐盐碱（如木麻黄） ，耐酸碱（如杨梅）和水湿（如赤杨） 。目前已发现 8 科 25 属种非豆科植物能与弗兰氏菌共生结瘤固氮。2、国内外对生物固氮的研究现状2.1 国外生物固氮的研究进展资料显示，1997 年美国豆科植物根瘤菌生物固定的氮素已达 620 万吨,占美国当年氮肥消耗的 55以上，随着豆科种植业的发展，至 2002 年美国化学氮肥消耗量已降至 1087 万吨左右。1990 年，澳大利亚年消耗化学氮肥 44 万吨，而豆科植物根瘤菌固定
9、的氮素却有 140 万吨，是化学氮肥使用量的 3 倍多。巴西种植大豆全部不用氮肥，只接种根瘤菌剂，大豆产量仅次于阿根廷，居世界第二，每年仅节约的氮肥价值就达 25 亿美元之多 3。可见，国际方面对生物固氮技术应用较为重视，开发研究较为先进，他们利用此项技术，正积极开发新的固氮菌剂，以达到农业增产的效果。施用各种新型的固氮菌剂可以使植物增产显著，为一些对条件较为苛刻的农作物增产提供了广阔的发展前景。2.2 我国生物固氮的研究现状在国内，遗憾的是，自 20 世纪 80 年代以来，我国报刊上一再不符合实际安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）4地宣传我国民间“发明家”已解决了生物固氮的大难题，
10、如“非豆科植物人工接瘤固氮成功”和“生物肥料可以代替化学肥料”等，干扰我国生物固氮的基础研究。虽然在“六五” 、 “七五” 、 “八五”和“九五”期间的“863”计划中列有生物固氮研究项目，且国家自然科学基金保留了少数研究项目，但资助强度不大，每年由“863”计划和国家自然科学基金资助的经费总共不到 100 万元，还不及美国一个课题的年资助费用；而应用基础研究（如根瘤菌应用技术的研究） ，因无处申请经费，已基本陷于停顿。 “八五” “攀登计划”的“最佳结瘤固氮模式”重大课题，由于立项模糊和组织不当，除化学模拟的研究外，未取得应有成果而被取消。但在困难条件下，很多研究人员还是作出了一些高水平的成
11、果，如：（1）在我国豆科植物根瘤菌和非豆科植物结瘤弗兰克氏菌的资源调查和分类方面，研究人员已坚持工作 20 多年，逐步摸清了我国豆科植物根瘤菌和非豆科植物结瘤弗兰克氏菌的资源 4，5 。 （2）在花生、大豆和豆科牧草接种根瘤菌的应用研究方面，做了大量的工作，并取得了明显的经济和社会效益6，7 。 （3）在固氮分子遗传学研究方面，我国处于世界先进行列。中科院上海植物生理学研究所固氮分子生物学研究室是国际上著名的实验室，20 世纪 70年代对固氮基因精细结构的研究就已进入国际先进行列。20 世纪 80 年代在固氮基因正调控基因 nifA 研究方面又有突出成果，构建成不受氨调控的组成性表达的 nif
12、A，并引入阴沟肠杆菌用于接种水稻，可获增产。进入 20 世纪 90 年代，在苜蓿根瘤菌结瘤基因的表达和调控方面，发现结瘤基因 nodD3 的表达不受植物类黄酮物质的启动，为扩大宿主范围的研究提供了依据 8，9 。 （4）有关固氮酶催化机理和化学模拟研究。我国学者于 20 世纪 80 年代初，证明在有 D2无 N2的条件下，固氮酶不能催化 HD 形成，对国外学者发表的不依赖 N2也可形成 HD的观点提出异议。20 世纪 90 年代初，论证了在生理条件下固氮酶每还原 1 mol N2所放出 H2的摩尔数不是 l，不符合通常的生物固氮化学反应计量式，因而提出了固氮酶双位点放 H2的假说 10。可以看
13、出，目前国内的研究集中以根瘤为研究对象，展开了一系列研究。但是我国目前生物固氮基础研究仍处于困境，队伍老化，青年科技人员外流，这样下去不能不令人担忧这个全世界都在关注的重大研究课题，因此，卢嘉锡、蔡启瑞等多位院士提出加强生物固氮基础研究的建议。3、生物固氮的意义及其在农业生产中的应用安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）53.1 生物固氮的意义氮是自然界中动物、植物、微生物不可缺少的生命元素,也是农业生产的重要限制因子。长期以来，由于化肥的大量使用，不仅浪费了大量的能源，提高了农业生产的成本，而且严重的污染了环境，破坏了生态平衡。生物固氮可将大气中游离氮素转化为生物新陈代谢所需的氨态氮，
14、为农作物提供氮素。与化学肥料相比，生物固氮既不降低土壤肥力，也不污染环境，而且是取之不尽，用之不竭的廉价氮源。有效利用生物固定的氮素可减少氮肥使用，缓解环境污染，实现农业的可持续发展。3.2 生物固氮在农业生产中的应用 生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量元素,土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失,土壤的含氮量就会下降。土壤可以通过两条途径获得氮素：一是含氮肥料(包括氮素化肥和各种农家肥料)的施用；另一种是生物固氮。科学家在 20 世纪 80 年代推算过,全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8107t，而自然界每年通过生物
15、固氮所提供的氮素则高达 4108t3。工业生产化肥还会污染环境,而微生物固氮则不会损害环境。所以,大力推广微生物固氮是十分必要的。可以用下列几种方式增强生物固氮的作用。施用根瘤菌肥料 1对豆科作物进行根瘤菌拌种,是提高豆科作物产量的一项有效措施。播种前将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应的根瘤菌,这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮。对比实验表明,在其他条件相同的情况下,经过根瘤菌拌种的豆科作物,可以增产 10%-20%。根瘤菌的主要功能之一就是能溶解、活化土壤养分,并具有强大的吸收能力,改善作物矿物质营养,它们对植物水分代谢的有益作用已基本得到公认。大量试验结果表明,菌根真菌能提高植物的抗旱
16、性、抗病性,促进生长发育,增加产量。当前,世界各国都在加紧研究和开发菌根应用技术。用豆科植物做绿肥 2将田菁、苜蓿或紫云英等的新鲜植株直接耕埋或堆沤后施用到农田中,可以明显增加土壤中氮的含量。科学家统计过,一般地说,农田施用 7500kg/hm2绿肥,可以增产粮食 750kg。如果用新鲜的豆科作物饲养家畜,再将家畜的粪便还田,则安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）6既可以使土壤肥沃,又可以获得更多的粮食和畜产品。非豆科植物共生固氮 3共生固氮并不仅仅局限于豆科植物和根瘤菌互作体系中,在一些非豆科植物中也时有发生。在此过程中,参与固氮的微生物不是根瘤菌,而是其它种类的细菌。例如,固氮蓝细
17、菌可以同多种植物共生,水生蕨类植物满江红在其叶子的小孔中含有各种异形的、可以固氮的鲢鱼腥蓝细菌。几个世纪以前,人们就有意识地利用满江红固氮。具体方法是,在种植水稻前,农民们在水稻田表面撒盖上植物满江红,使该植物大量生长,等水稻生长后,由于水稻的竞争作用,导致满江红鲢鱼腥蓝细菌混合体死亡并释放出固定的氮,氮能被水稻所同化。通过这种作用,农民在不施用氮肥的情况下也可以获得高产的水稻。让非固氮农作物也能自行固氮 4这是人们的迫切愿望。可以肯定,非豆科作物一旦能够自行固氮,不仅能够明显地提高粮食产量,而且有利于生态环境的保护。将固氮细菌体内的固氮基因转移到非豆科粮食作物的细胞内,在固氮基因的调控下,让
18、非豆科粮食作物的细胞内合成出固氮酶并且固氮,这是解决非豆科粮食作物自行固氮的一条重要途径,这一途径叫做固氮基因工程。20 世纪 80 年代初期,科学家发现了某种固氮细菌的固氮基因。这些固氮基因多达二十几个,它们共同调控该种细菌的固氮功能。科学家将这些固氮基因转移到大肠杆菌这种原核生物的细胞里,使本来不能固氮的大肠杆菌变成了能够固氮的大肠杆菌。随后,科学家又把固氮基因转移到酵母菌这种最简单的单细胞真核生物中,但是这种酵母菌只能合成出构成固氮酶的部分蛋白质。科学家最终希望的是把固氮基因转移到小麦、水稻等粮食作物的体内,并且让这些农作物自行固氮。遗憾的是,这样的实验至今还没有获得成功。这说明在原核生
19、物之间进行固氮基因的转移并且实现固氮比较容易,而将固氮基因从原核生物转移到真核生物中,使小麦、水稻等真核生物实现生物固氮,困难就大得多了。目前,科学家正在为实现固氮基因工程这一令人向往的目标而不懈努力着。创造自生固氮菌生长环境 5自生固氮菌适应于土壤中含大量有机质的环境中生长,长期施用化肥会使土壤酸化并板结,不利于微生物生长,破坏了土壤的有机质。所以,我们要多施农家肥少施化肥,督促秸秆还田,增加土壤中有机质含量,改善土壤环境。禁止秸秆焚安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）7烧,保护生态环境。合理种植:实施粮食作物与豆科植物合理的轮作,其主要结构为:麦类-大豆-玉米-饲料。合理施肥:以有
20、机肥为主、有机肥与化肥结合使用的施肥原则。大力推广微生物肥料的开发和利用。总之,保护环境发展生态农业是一个长期的过程,是造福子孙后代的大事。4、生物固氮在农业生产中的应用前景从战略上考虑,正确的农业生产政策应当既增加粮食产量,又不破坏土地的持续生产力和生态环境。而生物固氮正好能同时满足上述两个目的,因此被列为“国际生物学计划”的重要研究项目,得到日本、美国、欧洲 1等国家和地区的重视。非豆科植物尤其是禾本科植物与人类休戚相关。应用现代科技建立完善的非豆科植物生物固氮体系已经成为解决人类目前面临的人口、粮食、能源和环境等问题的重要措施之一。当前,使非豆科植物获得生物固氮能力的主要思路和技术策略大
21、致如下:构建转固氮基因非豆科植物 1通过基因工程将固氮基因转移到非豆科植物使之直接获得固氮能力,是目前生物固氮研究领域的一个热点课题。张中林等 11利用基因枪轰击法将固氮酶铁蛋白基因(nifH 基因)转入烟草叶片,PCR 检测及 Southern 杂交鉴定结果表明,nifH 基因已经整合到叶绿体基因组上,Western 免疫沉淀法的测定结果表明,nifH 基因能在叶绿体原核环境中表达。近年来,国内外同类研究非常活跃,并初见曙光 11。但是从目前的研究现状看,这种技术策略在短期内尚难达到预期目标。主要原因是:要使非豆科植物真正获得较高的固氮能力,至少需要包括nifH 基因在内的 16 个基因的转
22、移；所有 nif 基因均来自原核生物,与非豆科植物基因组内的真核环境很难亲和；生物固氮是一个耗能过程,如何提供固氮过程所必需的足够 ATP(能量),也是目前亟需解决的重大课题。根瘤菌直接侵染非豆科植物 2当前,实现根瘤菌直接侵染非豆科植物的主要技术策略是:人工诱导根瘤菌侵染非豆科植物。由于根瘤菌与宿主植物的共生关系具有相当高的特异性,因此,要使根瘤菌直接侵染非豆科植物,必须打破这种特异性。目前,主要通过植物激素方法、酶学方法或外源凝集素基因(pl 基因)转化方法等打破根瘤菌直接侵染非豆科植物的障碍 12,13.Diaz 等 14将豌豆 pl 基因转入三叶草,结果发现,转安顺学院 2012 届专
23、科生毕业论文（设计）8化的三叶草能被自然状态下侵染豌豆的根瘤菌侵染,而对照的未转化三叶草则不能被侵染。Zhang J.X.等 15应用根癌土壤杆菌介导法将豌豆 pl 基因和血红蛋白基因导入烟草,使豌豆根瘤菌侵染烟草成为可能.筛选能在非豆科植物根圈或根内自然定殖的根瘤菌菌株。目前,国内外学者已筛选出了一些能在玉米、小麦或水稻等的根部自然定殖的根瘤菌菌株 16,17。开发弗兰克菌在非豆科植物固氮上的潜力 3弗兰克菌具有跨越植物科、属、种结瘤固氮的能力,寄主植物多达 8 科、24属、230 多种,因此被认为是构建新型固氮非豆科植物的理想材料。利用植物内生固氮菌 4研究发现,大多数外部联合固氮菌促进宿
24、主植物生长的主要原因并不是为植物提供了充足的氮素肥料,而是固氮菌产生的植物激素影响了植物的生理过程 18。与之相比,内生固氮菌则可为植物提供充足的氮肥。据调查,巴西甘蔗田中 60%的氮肥由内生固氮菌提供。内生固氮菌的发现和研究,有望开辟一条非豆科植物高效利用生物固氮的捷径。此外,固氮酶的化学模拟研究也是生物固氮研究的重要分支。人们从天然固氮酶的组分、组分及其金属原子簇得到启发,提出了多种固氮酶化学模型,例如过渡金属(铁、钴、镍等)的氮配位化合物、过渡金属(钒、钛等)的氮化物、过渡金属的氨基酸配位化合物、石墨配位化合物等 19。模拟天然固氮酶在常温常压下还原 N2，可能使工业合成氨催化剂发生革命
25、性变化。5、结论与展望总之，生物固氮是个非常复杂的问题。它在农业上能增强土壤肥力，为提高作物产量和质量发挥重要作用；同时，在净化环境、维持生态平衡方面也起着重要作用；而且固氮微生物不仅与高等植物建立共生固氮体系，还可以与某些昆虫及更高级动物建立自主固氮模式。这些都为未来研究带来了动力，指明了方向。综上可知,生物固氮对农业的可持续发展具有至关重要的战略意义,生物固氮在农业中的应用前景十分广阔。当前,应当继续开拓和完善非豆科植物高效利用生物固氮的技术策略,尽快解决生物固氮基础研究经费不足等问题 1,使与农业、生命科学以及生态环境保护 18密切相关的生物固氮研究得到飞跃式发展,从而为使作为农业大国的
26、我国立于世界强国之林做出应有的贡献！安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）9主要参考文献1卢嘉锡等.科学新闻周刊，20002；（39） ；第 6 版2张苏艳、刘圆圆、李慧敏等 生物固氮菌的应用J.畜牧兽医杂志.2010 29（4）.P 40-413梅隆 . 发展生物固氮产业势在必行N.农民日报，2009 年 7 月 13 日 . 007 版.4白建军，史清亮.柠条与沙棘共生固氮菌资源特性对比分析J.山西农业科学，2008，36（9）：49-52.5陈文新.中国豆科植物根瘤菌资源多样性与系统发育J. 生物多样性，2004，9（2）：6-8.6熊智，张成刚，张忠泽，等.交叉接种后固氮放线菌基
27、因稳定性研究J.西南林学院学报，2003，23（3）：1-4.7潘江，朱万昌，徐建波，等.毛赤杨根瘤固氮作用的初步研究J.林业科技，1999，24（2）：6-8.8上海植物生理研究所固氮研究室共生固氮组.非豆科植物固氮能力的研究J.植物学报，1997，19（4）：247-251.9朱冰，戴小密，朱家璧.苜蓿根瘤菌 nodD3P1 启动子下游序列的调节功能J.科学通报，1999，44（21）：2308-2312.10Yu G Q， Zhu J B，Gu J，et al.Evidence that the nodulation regulatory gene nodD3 of Rhizobium
28、meliloti is transcribed from two separate promotersJ.Science in China，Ser B，1993，36：225-236.11张中林、钱凯先、沈桂芳.科学通报，2001:46（12）：1026-103012程红梅等.科学通报，2000；45（4）：377-38113Al-Mallah M.K.,Davey M.R.,Cocking E.C.Journal of Experrimental Botany,1989；40（213）：47314Diaz C.L.,et al.Nature,1989；1989；338：579-58115Zh
29、ang J.X.,et al.Acta Botaniaca Sinica,2000；42（8）：834-84016Pueppke S.G.,Broughton W.J.Mol.Plant-Microbe Interact,1999；12（4）：293-31817王平，王勤，冯新梅.华中农业大学学报，1999；18（3）：238-24118居乃琥.工业微生物，2001；31（1）：37-4519张华峰.新型固氮酶铬铁蛋白的特性与晶体生长研究.D.沈阳：沈阳农业大学，200120Paccl E.Bishop 生物科学动态 1988(3)-47 6微生物学报 199219(1).34-3721陈因
30、生物科学动态 1-58-59.197822洪国藩宋鸿遇：固氮之光 ，湖南科学技术出版社，199723陈文新，陈文峰 . 发挥生物固氮作用 减少化学氮肥用量 J . 中国农业科技导报 ,2004,6(6):3-6. 安顺学院 2012 届专科生毕业论文（设计）1024黄群策，陈启锋，李志真 . 生物固氮研究的前景J . 科技导报 , 1999 （1）:27.25赵琳 . 生物固氮与生态农业J.江西农业学报，2006，18（5）26张华峰，胡建成，黄巨富.生物固氮在农业中应用现状与展望J.自然杂志，2002，24（3）27陈钢.生物固氮与农业经济的可持续发展J.商场现代化，2008，25谢 辞通过
31、该课题的探讨，实现和论文撰写，我从中学到了很多东西。学会了确定问题，分析问题再到解决问题的严谨思路。在这个过程中，首先要感谢我的导师刁锐琦。刁老师结合自己的研究领域和时下的研究热点，帮我确定研究方向，并鼓励我大胆地尝试。在遇到一些方案性问题时，刁老师总能用他丰富的经验给我方向性的指导。在刁老师的督促和鼓励下，我的论文才得以顺利完成。同时，在论文写作过程中，我还参考了有关的书籍和论文，在这里一并向有关的作者表示谢意。我还要感谢同组的各位同学，在毕业设计的这段时间里，你们给了我很多的启发，提出了很多宝贵的意见，对于你们的帮助和支持，在此我表示深深地感谢。做完这篇论文，我们很多人将挥别校园，走向社会。祝愿大家都有快乐灿烂的人生。
